Nijs

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Kankerzellen hawwe ferskate meganismen ûntwikkele om sellulêre stress te oerwinnen en troch te gean foarút.Proteinkinase R (PKR) en har proteïneaktivator (PACT) binne de earste responders dy't ferskate stresssinjalen kontrolearje dy't liede ta remming fan selproliferaasje en apoptose.De regeling fan it PACT-PKR-paad yn kankersellen bliuwt lykwols foar in grut part ûnbekend.Hjir fûnen wy dat lange net-kodearjende RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) direkt belutsen is by de ynhibysje fan it PACT-PKR-paad en proliferearret kankersellen.Mei help fan grutskalige funksjonele screening fan CRISPRi 971 kanker-assosjearre lncRNA, fûnen wy dat DARS-AS1 assosjearre wie mei signifikant ferbettere proliferaasje fan kankersellen.Dêrom ynhibeart DARS-AS1-knockout selproliferaasje en befoarderet kankerselapoptose yn ferskate kankersellinen in vitro en ferminderet tumorgroei yn vivo signifikant.Meganysk bindet DARS-AS1 direkt oan it PACT-aktivearringsdomein en foarkomt PACT-PKR-ynteraksje, wêrtroch PKR-aktivearring, eIF2α-phosphorylaasje, en apoptotyske seldea ynhibearret.Klinysk wurdt DARS-AS1 breed útdrukt yn meardere kankers, en oerekspresje fan dit lncRNA is in oantsjutting foar in minne prognose.Dizze stúdzje ferljochtet kankerspesifike regeling fan 'e PACT-PKR-paad troch DARS-AS1 lncRNA en leveret in oar doel foar kankerprognose en behanneling.
De mooglikheid om oan te passen oan stress is in wichtich skaaimerk fan it oerlibjen en proliferaasje fan kankersellen.De rappe proliferaasje en metabolike skaaimerken fan kanker pyk yn hurde mikroomjouwings - fiedingsferbrûk, hypoxia, en lege pH - dat kin sinjalearpaden foar selle-dea triggerje.Dysregulaasje fan stress-sensitive genen lykas p535, heat shock proteins 6, 7, KRAS8, 9, en HIF-110, 11, 12, 13 wurdt faak waarnommen yn kanker, dêrmei blokkearjende apoptose en it befoarderjen fan oerlibjen.
Proteinkinase R (PKR) is in wichtige stresssensor en subunitkinase fan eukaryotyske inisjatyffaktor 2α (eIF2α), in translaasjeregulator dy't sellulêre stress ferbynt mei seldea.PKR waard oarspronklik identifisearre as in antivirale proteïne troch de detectie fan in frjemde dûbelstrenged RNA (dsRNA).By aktivearring phosphorylates PKR eIF2α om virale en sellulêre proteïnesynthese14,15,16 te ynhibearjen.PACT (PKR-aktivatorprotein) is identifisearre as it earste PKR-aktivatorprotein yn it ûntbrekken fan dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Troch direkte ynteraksje mei PKR transduceart PACT ferskate spanningen (serumhonger, peroxide of arsenytbehanneling) nei PKR en streamôfwerts sinjaalpaden.Njonken eIF2α-fosforylaasje trigger PACT-bemiddele PKR-aktivearring ferskate eveneminten ferbûn mei de stress-antwurd, ynklusyf feroare redoxstatus fia de PI3K / Akt24-paad, ferbettere DNA-skeakontrôle fia p5325,26 en NF-κB27,28 Regelt transkripsje, 29. Sjoen har krityske rol yn stressreaksje, proliferaasje, apoptose en oare wichtige sellulêre prosessen, binne PKR en PACT belofte therapeutyske doelen foar in protte sykten, benammen kanker30,31,32,33.Lykwols, nettsjinsteande dizze pleiotropyske funksjonele en biologyske betsjutting, bliuwt de regeling fan PACT / PKR-aktiviteit yn kankersellen ûngrypber.
lncRNA's binne transkripsjes grutter dan 200 nukleotiden mei gjin proteïnekodearjend potinsjeel.Sûnt foarútstribjende projekten foar folchoarder fan it hiele genome tûzenen lncRNA's hawwe identifisearre, is 35,36 in protte muoite dien om har biologyske funksjes te ferklearjen.In groeiend lichem fan ûndersyk hat oantoand dat lncRNA's belutsen binne by in protte biologyske prosessen37, ynklusyf de regeling fan X-chromosome-ynaktivaasje38,39, imprinting40, transkripsje41,42, oersetting43 en sels kankergroei44,45,46,47.Dizze stúdzjes rapporteare dat in protte lncRNA's belutsen binne by it PACT / PKR-paad.Ien sa'n stúdzje liet sjen dat lncRNA ASPACT PACT-transkripsje ynhibearre en ferhege nukleêre retinsje fan PACT mRNA.Oare stúdzjes hawwe oantoand dat lncRNA nc886 bindet oan PKR en syn fosforylaasje ynhibeart49,50.Oant no is lncRNA dy't PACT-bemiddele PKR-aktivearring regelet net rapportearre.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) is identifisearre as in onkogene lncRNA51,52,53,54.Troch de regeling fan miP-194-5p53, miP-12952 en miP-532-3p51, is DARS-AS1 oantoand om de groei te befoarderjen fan respektivelik dúdlike sel-renale selkarsinoma, schildklierkarsinoom en net-lytse sel longkarsinoom.Tong en kollega's fûnen ek dat DARS-AS1 myelomaprogression befoarderet troch de stabiliteit fan it protein 39 (RBM39) RNA-binend motyf te behâlden.Der binne lykwols gjin stúdzjes útfierd oer oft dit lncRNA belutsen is by de regeling fan PACT-PKR-aktivearring en de stress-antwurd fan kankersellen.
Hjir hawwe wy in grutskalich ferlies-fan-funksje-skerm útfierd mei it CRISPRI-systeem en bepaald dat DARS-AS1 lncRNA de proliferaasje fan ferskate soarten kankersellen befoarderet.Dêrnjonken hawwe wy in wichtich meganisme identifisearre: DARS-AS1 bindet direkt oan PACT, ynhibearret PACT en PKR-bining, foarkomt phosphorylaasje fan eIF2α, in legere PKR-substraat, en remmet úteinlik apoptotyske selde dea.Ta beslút ûntbleatet ús wurk de DARS-AS1 lncRNA as in regulator fan it PACT-PKR-paad en in potinsjele doel foar kankerbehanneling en prognose.
Wiidweidige genomyske profilearringstúdzjes hawwe hûnderten lncRNA's identifisearre ferbûn mei kanker.Har funksje bliuwt lykwols foar in grut part ûnbekend56.Om kânsrike lncRNA-kandidaten te identifisearjen belutsen by kankerprogression, hawwe wy in ferlies-fan-funksje-skerm útfierd foar fermindere proliferaasje yn 'e SW620 kolorektale kankerselline mei it CRISPRi-systeem (fig. 1a).It unike skaaimerk fan 'e SW480 en SW620 kolonkanker sellen is dat se binne ôflaat fan primêre en sekundêre tumors yn ien pasjint.Dit soarget foar in weardefolle ferliking foar it bestudearjen fan genetyske feroaringen yn 'e foarútgong fan avansearre kolonkanker.Dêrom analysearren wy de transkriptomen fan kolorektale kankersellinen (SW480 en SW620) mei RNA-sekwinsje en sammele wat potensjele funksjonele lncRNA's út 'e publisearre literatuer.Op grûn fan dizze resultaten ûntwurpen wy in gearstalde sgRNA-bibleteek mei 7355 sgRNA-oligo's rjochte op 971 kanker-assosjearre lncRNA's en 500 untargeted sgRNA-oligo's foar in negative kontrôle (oanfoljende gegevens 1).
Skematyske werjefte fan screening mei it CRISPRi-systeem.b sgRNA ferriking nei screening.De horizontale stippelline stiet foar log2 (fold feroaring) = ± 0,58.De fertikale stippelline jout p wearde = 0,05.Swarte stippen fertsjintwurdigje net-doel sgRNA (oanwiisd as NC).Reade stippen binne sgRNA's dy't rjochte binne op DARS-AS1.Blauwe stippen binne sgRNA's rjochte op LINC00205, in earder beskreaun onkogene lncRNA.fold feroaring = (normalisearre lêzing, dei 17)/(normalisearre lêzing, dei 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown ynhibearre selgroei.Flaterbalken fertsjintwurdigje ± standertdeviaasje fan 'e trije eksperiminten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 twa-tailed Student syn t-test.d DARS-AS1 ekspresje yn tumors (TCGA dataset).em Ekspresje fan DARS-AS1 yn keppele normale en tumormonsters fan pasjinten mei respektivelik BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP en COAD (TCGA dataset).p-wearden waarden krigen mei in pear twa-tailed Student's t-test.
Nei it konstruearjen fan it plasmide en it ferpakking fan it lentivirus, transducearren wy de dCas9-SW620 kolorektale kankerselline mei de boppesteande bibleteek yn fjouwer ûnôfhinklike ynfeksje-eksperiminten.De mearfâldichheid fan ynfeksje (MOI) foar dizze ynfeksjes wie 0,1-0,3, wat oanjout dat elke sel allinich mei ien sgRNA kin wurde transfekteare.Nei 18 dagen fan in vitro kultuer, it ferriking profyl fan doel sgRNAs fermindere of ferhege nei screening, wylst it oantal net-rjochte kontrôle oligonucleotides bleau relatyf net feroare yn ferliking mei it pre-screening profyl, wat oanjout dat ús doel hat in tige skerm-spesifike biblioteek.Rys.1b en oanfoljende tabel 1). LINC00205, dy't earder rapportearre waard om longkanker en leverkankerprogression58,59,60 te befoarderjen, waard útskreaun (log2 (foldchange) <-0.58, p wearde <0.05), befêstigje de betrouberens fan dizze screening (Fig. 1b). LINC00205, dy't earder rapportearre waard om longkanker en leverkankerprogression58,59,60 te befoarderjen, waard útskreaun (log2 (foldchange) <-0.58, p wearde <0.05), befêstigje de betrouberens fan dizze screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, earder rapportearre om de foarútgong fan longkanker en leverkanker58,59,60 te befoarderjen, waard útsletten (log2 (fold feroaring) <-0.58, p-wearde <0.05), befêstiget de robústiteit fan dizze screening (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 促进 和 肝癌 进展 58.59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, P 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 促进 和 肝癌 进展 58.59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, P 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, earder rapportearre foar it befoarderjen fan long- en leverkankerprogression58,59,60, waard útsletten (log2 (foldwiziging) <-0.58, p-wearde <0.05), befêstiget de robústiteit fan dizze screening (Fig. .1b).
Under alle ûndersochte lncRNA's waard DARS-AS1 ek ûndersocht, mei de trije kognate sgRNA-oligonucleotides signifikant fermindere nei 18 dagen fan kultuer, wat suggerearret dat knockdown fan dit lncRNA resultearre yn fermindere kankerproliferaasje (Fig. 1b).Dit resultaat waard fierder stipe troch MTS-analyze yn kolorektale kankersellen dy't sjen litte dat it groeitempo fan DARS-AS1 knockdown-sellen allinich halve waard yn ferliking mei kontrôlesellen (figuer 1c) en wie konsistint mei eardere rapporten fan ferskate oare kankersoarten.: dúdlike sel nierkanker, schildklierkanker en net-lytse sel longkanker51,52,53,55.Syn funksje en molekulêre meganismen yn kolorektale kanker bliuwe lykwols net ûndersocht.Dêrom hawwe wy dizze lncRNA keazen foar fierdere stúdzje.
Om DARS-AS1-ekspresje yn pasjinten te studearjen, analysearren wy wiidweidich 10,327 tumormonsters út it Cancer Genome Atlas (TCGA) projekt.Us resultaten litte sjen dat DARS-AS1 wiid útdrukt en signifikant opregulearre wurdt yn sûne sellen yn in ferskaat oan tumors, ynklusyf colon adenocarcinoma (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC), en renal papillary cell carcinoma (KIRP)..Hiel pear (Fig. 1d en Oanfoljende Fig. 1a, b). Analyse fan keppele sûne/tumormonsters befêstige fierder in signifikant hegere ekspresje fan DARS-AS1 yn 'e tumors fan bladder urothelial carcinoma (BLCA), nieren renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), long squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), lever hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), en colon adenocarcinoma (COAD) (p wearde <0.05) (fig. 1e–m) . Analyse fan keppele sûne/tumormonsters befêstige fierder in signifikant hegere ekspresje fan DARS-AS1 yn 'e tumors fan bladder urothelial carcinoma (BLCA), nieren renal clear cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), long squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), lever hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), en colon adenocarcinoma (COAD) (p wearde <0.05) (fig. 1e–m) .Analyse fan keppele sûne/tumor-samples befêstige ek signifikant hegere ekspresje fan DARS-AS1 yn bladder urothelial carcinoma (BLCA), clear cell renal en renal cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinoma (PRAD), long squamous cell carcinoma (LUSC) tumors., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometrial carcinoma fan it corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma fan 'e long (LUAD), hepatocellular carcinoma fan' e lever (LIHC), papillary cell carcinoma fan 'e nier (KIRP), en adenocarcinoma fan' e kolon (COAD) (p wearde < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 分析 进一步 进一步 进一步 分析 分析 进一步 证实 证实 上 上 皮癌 (blca), 肾 肾 透明 细胞癌 (Kirc), 前列前列 (Prad), 肺鳞状肺鳞状 (Lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (cCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (LIHC), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (KIRP) (COAD) (P 值<0.05）（图1e-m）.配 对 健康 / 肿瘤样本 肿瘤样本 的了 证实 证实 dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 前列 前列 腺腺癌 前列(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 高 表达 内膜 癌 癌 高 表达 内膜 癌 (Luad) 肝肝 细胞癌 (LIHC) 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m）.Analyse fan sûne/tumor-paarde samples stipe fierder de rol fan DARS-AS1 yn bladder urothelial carcinoma (BLCA), clear cell renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), en long squamous cell carcinoma (LUSC) tumors.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresje yn corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), en colon adenocarcinoma (COAD) (p wearde <0.05) (figuer 1e -m).Mei-inoar jouwe dizze resultaten oan dat DARS-AS1 breed en heech útdrukt wurdt yn in ferskaat oan kankers.
Om't DARS-AS1 en DARS (it gen dat kodearret foar de antisense-string) deselde promotor diele en njonken elkoar lizze, hawwe wy shRNA ûntworpen om DARS-AS1 spesifyk te knockdown mar net DARS (oanfoljende Fig. 2a,b en Oanfoljende Tabel 2) .Neist SW620 brûkten wy ek trije oare sellenlinen dy't DARS-AS1 tige útdrukke om de effektiviteit en funksje fan shRNA-knockdown te studearjen (oanfoljende tabel 3).Us resultaten jouwe oan dat alle trije ûntwikkele shRNA's op syn minst 80% DARS-AS1 knockdown-effisjinsje berikke mei in bytsje effekt op it bedrach fan DARS mRNA (oanfoljende Fig. 2c-f).Derneist fûnen wy dat DARS-AS1-knockdown mei dizze shRNA's selgroei signifikant ynhibearre yn kolorektale kankersellinen SW620 (49.7%) en HCT116 (27.7%), boarstkanker-selline MBA-MD-231 (53.4%).) en de HepG2 hepatoma cell line (92.7% reduksje), en ek harren fermogen om te foarmjen unanchored sfearen (gemiddelde reduksje fan ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% en 75.7% per cell line) (Fig. 2a, b).Yn SW620, de resultaten fan de koloanje formaasje assay fierder befêstige dat DARS-AS1 shRNA signifikant inhibited sel proliferaasje mei in gemiddelde delgong fan likernôch 69,6% (Fig. 2c).
Effekt fan kontrôle shRNA en DARS-AS1 shRNA op selproliferaasje (a) en spheroïde formaasje (b) yn SW620, HCT116, MBA-MD-231, en HepG2-sellen.c Effekt fan kontrôle shRNA en DARS-AS1 shRNA op koloanjefoarming yn SW620-sellen.Selproliferaasje (d), sferoïdefoarming (e), en koloanjefoarming (f) fan SW620-sellen dy't DARS-AS1 overexpressearje.Gegevens werjûn binne de gemiddelde ± standertdeviaasje fan trije eksperiminten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, en *** p ≤ 0,001 troch twa-tailed Student syn t-test.
Om stúdzjes foar ferlies fan funksje oan te foljen, makken wy neist SW620-sellen dy't DARS-AS1 overexpressearje (Supplementary Fig. 2g).DARS-AS1-overekspresje signifikant ferhege sel groei (1.8-fold), unanchored spheroid formaasje (1.4-fold), en koloanje formaasje (3.3-fold) yn SW620 sellen (Fig. 2d-f).Wy befêstige dit resultaat mei in oare DARS-AS1-ekspresje selline, A549.Dizze fersterke selproliferaasje troch DARS-AS1-overekspresje waard fierder waarnommen yn A549-sellen (oanfoljende figuer 2h, i en oanfoljende tabel 3).Mei-inoar bewize dizze winst- en ferliesstúdzjes dat DARS-AS1 proliferaasje fan kankersellen in vitro befoarderet.
Om it ûnderlizzende meganisme te ûndersiikjen wêrmei DARS-AS1 selproliferaasje regelet, hawwe wy in RNA-pull-down-analyse útfierd om har potensjele proteïne-binende partners te identifisearjen.RT-qPCR-resultaten lieten sjen dat sawat 86,2% fan DARS-AS1 leit yn it cytoplasma fan SW620-sellen (Supplementary Fig. 3a).De in vitro transkribearre biotinylearre DARS-AS1 of pseudoRNA waard doe ynkubeare mei SW620-sellysaten folge troch SDS-PAGE-skieding.Folgjende sulveren kleuring liet sjen dat in ûnderskate band (~ 38 kDa) signifikant ferrike waard yn DARS-AS1 pull-samples, mar net yn dummy-RNA- of kralenmonsters (fig. 3a).Dizze band waard identifisearre as in PKR-aktivearjende proteïne (PACT) troch massaspektrometry (MS) en fierder befêstige troch immunoblotting yn SW620, HCT116, en HepG2-sellinen (Fig. 3a, b).De ferriking fan DARS en relatearre PACT-proteinen - PKR en TRBP - waard ek ûndersocht mei RNA-analyze troch Western blotting (WB).De resultaten jouwe oan dat gjin direkte ynteraksje tusken DARS-AS1 RNA en dizze trije aaiwiten fûn waard (Supplementary Fig. 3b).De spesifike ynteraksje tusken DARS-AS1 en PACT waard fierder befêstige troch RNA-immunoprecipitaasje (RIP) analyze, dy't sjen liet dat DARS-AS1 signifikant ferrike waard yn anty-PACT-antylders, mar net oare kontrôle-RNA's (figuer 3c).Om te bepalen as DARS-AS1 direkt ynteraksje mei PACT yn it ûntbrekken fan oare sellulêre komponinten, waard in in vitro biolayer interferometry (BLI) assay útfierd mei suvere PACT.Biotine-labele DARS-AS1 of dummy RNA waard ymmobilisearre op streptavidin (SA) biosensors en dan ynkubeare yn kinetyske buffer mei 1 μM PACT.Opmerklik bûn PACT sterk oan DARS-AS1 (KD-wearde ~26.9 nM), mar net om RNA te mimikjen (figuer 3d).Mei-inoar bewize dizze resultaten in direkte ynteraksje en hege affiniteit tusken DARS-AS1 en PACT.
RNA pull-analyse identifisearre DARS-AS1 ynteraksje mei PACT yn SW620-sellen.Boppe, sulveren kleuring fan besibbe aaiwiten.Legere immunoblots waarden útfierd mei anty-PACT antykody.b RNA pull-down analyze waard útfierd yn HCT116 (boppe) en HepG2 (ûnder) sellen.PACT-ferriking waard ûntdutsen troch immunoblotting.cRNA-immunoprecipitaasje (RIP) assays waarden útfierd yn SW620-sellen mei de oantsjutte antykladen.d PACT binende krommes nei DARS-AS1 of kontrôle RNA waarden krigen mei biolayer interferometry (BLI).RNA waard ymmobilisearre op in streptavidin biosensor.1 μM PACT waard brûkt om assosjaasje te mjitten.e RNA pull-assay waard útfierd mei biotinylearre DARS-AS1 mei folsleine lingte of ôfkoarte (boppe).Immunoblot toant PACT ûntfongen (ûnder).f Purified flagge PACT waard incubated mei biotinylated folsleine-lingte DARS-AS1 of truncated (lykas yn e) foar in vitro RIP assay.De ekstrahearre RNA waard ferifiearre troch RT-qPCR.g De relative affiniteit fan ferskate RNA-fragminten foar PACT waard krigen mei biolayer-interferometry.Foar analyse waarden 100 nM RNA en 1 μM RAST brûkt.h In vitro RIP-assays waarden útfierd mei suvere yntakt of ôfkoarte markearre PACT.De ekstrahearre RNA waard ferifiearre troch RT-qPCR.i Groei rate fan SW620 sellen overexpressing DARS-AS1, PACT, of beide.j Overexpresje fan folsleine-lingte of ôfkoarte DARS-AS1 yn SW620-sellen hie ferskate effekten op selgroei.k Apoptosis waard ûntdutsen troch immunoblotting mei anty-PARP antybody.l Knockout fan DARS-AS1 induces apoptosis fan SW620 sellen lykas werjûn troch flow cytometry.Gegevens werjûn binne de gemiddelde ± standertdeviaasje fan trije eksperiminten. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, troch twa-tailed Student's t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, troch twa-tailed Student's t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 troch twa-tailed Student's t-test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 troch twa-tailed Student's t-test.
Wy genereare doe trije biotinylearre DARS-AS1 RNA-fragminten troch in vitro-transkripsje om de DARS-AS1-regio te identifisearjen dy't nedich is foar PACT-feriening (figuer 3e).De resultaten fan RNA-analyze lieten sjen dat elk fragmint yn steat wie om te ynteraksje mei PACT, mar de 3'-terminale regio (384-768 nukleotiden markearre A3) toande mear as 1-384 nukleotiden markearre A1) (fig. 3e).Fergelykbere resultaten waarden beoardiele yn 'e in vitro RIP-assay mei rekombinante PACT (figuer 3f).Yn oerienstimming mei dizze resultaten hawwe eksperiminten om ymmobilisearre RNA-fragminten te binen oan PACT mei BLI te sjen dat PACT in hegere affiniteit hat foar A3 (384-768 nt) (KD-wearde fan sawat 94.6 nM), wylst hast gjin keppelings mei oare gebieten.(ôfb. 3d).
Wy ûndersochten ek de assosjearre binende regio's yn PACT.PACT befettet trije funksjonele domeinen, wêrfan twa bewarre dûbele strâne RNA-binende domeinen (dsRBD) en in tredde domein (oanwiisd D3) dat fungearret as aktivator fan proteïne-ynteraksjes.Om de lncRNA-binende kapasiteit fan elk domein te ûndersiikjen, hawwe wy trije mutaasjes makke dy't elk fan 'e trije domeinen fuortsmiten en in in vitro RIP-assay útfierden.Us resultaten lieten sjen dat wiskjen fan it tredde domein (D3) fan PACT syn ynteraksje mei DARS-AS1 signifikant fermindere (troch 0.11-fold yn ferliking mei yntakt PACT) yn ferliking mei de oare twa mutaasjes (Fig. 3h), it waard oantoand dat de frijlitting fan D3 ynteraksje mei DARS.-AC1.Mei-elkoar suggerearje dizze resultaten dat ynteraksje tusken DARS-AS1 en PACT primêr kin foarkomme fia it 3′-ein fan DARS-AS1 en it D3-domein fan PACT.
Wy konstatearren dat DARS-AS1 gjin effekt hie op PACT-ekspresje en PACT hie gjin effekt op DARS-AS1 (Supplementary Fig. 3c).Wy ûndersochten doe it effekt fan PACT-knockdown op selgroei.Yn tsjinstelling ta DARS-AS1 groeiden relative sellen 1,5-3 kear flugger doe't PACT waard delslein (Supplementary Fig. 3d).De resultaten fan de koloanje formaasje assay oanjûn dat de sellen foarme 2-3-fold koloanjes nei shRNA behanneling mei PACT (Supplementary Fig. 3e).Om te testen oft DARS-AS1 selproliferaasje regelet fia PACT, hawwe wy SW620-sellen generearre dy't PACT, DARS-AS1, of beide oerekspresje.Overexpresje fan PACT toande signifikante ynhibysje fan selproliferaasje (figuer 3i).Wylst DARS-AS1-overekspresje per se de selproliferaasje signifikant befoardere, wie d'r gjin signifikant ferskil yn 'e groei fan sellen dy't DARS-AS1 en PACT oerekspresje.Dizze resultaten suggerearje dat PACT de ferhege proliferaasje kin tsjingean feroarsake troch DARS-AS1-overekspresje.
Om't ferskate regio's fan DARS-AS1 ferskillende PACT-binende kapasiteiten hawwe, ûndersochten wy har relative ynfloed op selproliferaasje troch ferskate oerekspresje fan DARS-AS1-fragminten.Yn ferliking mei de oare twa fragminten waard DARS-AS1 overexpressed oan 'e 3'-ein (384-768 nt), de wichtichste PACT-relatearre regio yn DARS-AS1, dy't de heechste fermogen hie om selproliferaasje te stimulearjen (fig. 3j).Dizze resultaten jouwe in positive korrelaasje oan tusken de binende kapasiteit en biologyske funksje fan DARS-AS1.
PACT is rapportearre as in pro-apoptotysk proteïne19.Dêrom ûndersochten wy it effekt fan DARS-AS1 op apoptose.Lykas ferwachte, ferhege DARS-AS1-knockdown signifikant PARP-spalt yn SW620-sellen en fergrutte it oanpart fan annexin V-positive sellen yn SW620, HCT116, HepG2, en MBA-MD-231-sellinen (fig. 3k).3).3f-h), wat oanjout dat it anty-apoptotyske effekt fan DARS-AS1 yn kankersellen tsjinoersteld is oan 'e apoptose-inducerende funksje fan PACT.Mei-inoar suggerearje dizze resultaten dat it meganisme fan DARS-AS1 onkogene funksje kin wêze troch ynhibysje fan PACT-funksje.
Dêrnei ûndersochten wy de funksjonele gefolgen fan 'e DARS-AS1-PACT-feriening.PACT is rapportearre om PKR te aktivearjen fia direkte ynteraksje, dy't dêrnei eIF2α-fosforylaasje ferbettert, wêrtroch translationele deletion en apoptosis17 feroarsaakje.Earst hawwe wy ûndersocht oft DARS-AS1 de sellulêre lokalisaasje fan PACT en PKR beynfloedet.Konfokale fluoreszensmikroskopy liet sjen dat PACT en PKR sterk kolokalisearre waarden yn SW620-sellen mei in gemiddelde Pearson-korrelaasjekoëffisjint fan 0.72.Underwilens fermindere DARS-AS1-overekspresje signifikant PACT- en PKR-ko-lokalisaasje (gemiddelde Pearson-korrelaasjekoëffisjint 0.61) (figuer 4a).Om te ûndersiikjen oft DARS-AS1 de PACT-PKR-ynteraksje koe modulearje, hawwe wy in co-immunoprecipitaasje (co-IP) assay útfierd mei anty-PACT antykody yn SW620-sellysaten.PKR waard tige ferrike yn anty-PACT yn kontrôle sellen, wylst PKR herstel waard gâns fermindere yn lysates út sellen overexpressing DARS-AS1 (Fig. 4b).Purified markearre PACT en PKR waarden brûkt foar in vitro protein binding assays.Dêrnjonken lieten dejingen dy't DARS-AS1 levere mar gjin kontrôle RNA ûnderdrukte PACT-PKR-ynteraksje sjen (figuer 4c).Alle resultaten lieten sjen dat DARS-AS1 PACT- en PKR-kommunikaasje fersteurde.
in Co-lokalisaasje fan PACT en PKR yn kontrôle sellen as sellen overexpressing DARS-AS1 waard waarnommen mei confocal fluorescence mikroskopy.De kearnen waarden kleurd mei DAPI.Statistyske resultaten waarden krigen fan 16 foto's.b Co-immunoprecipitaasje (co-IP) mei help fan anty-PACT antykodyk yn sel lysates fan kontrôle SW620 sellen as sellen overexpressing DARS-AS1.c Labeled PACT, suvere PKR en transkribearre yn vitro mei DARS-AS1 as mock RNA waarden ynkubeare foar in vitro protein binding analyze.Anti-flagge antykladen waarden brûkt foar immunoprecipitaasje.d Immunoblots mei de oantsjutte antykladen waarden útfierd yn SW620 en HCT116 sellen transfected mei kontrôle shRNA of DARS-AS1-shRNA folge troch serum starvation.e DARS-AS1 ekspresjenivo's feroare sellulêre gefoelichheid foar thapsigargin.SW620-sellen waarden transfekteare mei DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1-overekspresjeplasmide of kontrôleplasmide.Sellen waarden behannele mei thapsigargin foar 48 oeren en sellenviabiliteit waard bepaald mei it MTS-reagens.f In vitro transkribearre DARS-AS1 of dummy RNA en suvere PACT waarden brûkt foar in vitro aktivearring assay en immunoblot detection.g Immunoblots dy't dizze antykladen brûkten waarden útfierd op SW620-ctrl-sellen (links) as sellen dy't PKR-mutanten oerexpressearje (rjochts).Dizze sellen waarden doe transfekteare mei kontrôle shRNA of DARS-AS1-shRNA folge troch serumhonger.h Flowcytometry liet sjen dat ynaktivaasje fan 'e mutante PKR kompensearre foar DARS-AS1-induzearre apoptose yn SW620-sellen.i Immunoblots mei de oantsjutte antistoffen waarden útfierd yn SW620 (lofts) of HCT116 (rjochts) sellen.Sellen transfected mei kontrôle shRNA of DARS-AS1 shRNA binne serum-ûnthâlden en oanfolle mei 100 nM PKR C16 inhibitor of DMSO.Skaalbalke = 5 µm.Gegevens werjûn binne de gemiddelde ± standertdeviaasje fan trije eksperiminten.* p ≤ 0,05 twa-tailed Student syn t-test.
It wurdt algemien leaud dat ienris PACT ynteraktearret mei PKR17, PKR-fosforylaasje by Thr451 kin wurde induced.Us resultaten jouwe oan dat it nivo fan PKR-phosphorylaasje signifikant ferhege waard yn DARS-AS1-knockdown-sellen nei serum-honger (Fig. 4d en Supplementary Fig. 4a).Dêrtroch fûnen wy dat phosphorylaasje fan eIF2α, it haad PKR-substraat, ek signifikant ferhege waard troch DARS-AS1 shRNA (figuer 4d en oanfoljende figuer 4a).Thapsigargin is in ER-stressor dy't feroarsaket dat de ER Ca2+ frijlitte.Behanneling mei thapsigargin is rapportearre om de ekspresje en aktivearring fan PACT te stimulearjen, dy't fierder ynteraksje mei en aktivearret PKR, dy't liedt ta apoptose troch it fergrutsjen fan eIF2α-fosforylaasje 18,61.Hjir brûkten wy thapsigargin as stimulator fan 'e PACT / PKR-paad om te ûndersykjen oft DARS-AS1 sellen kin helpe om stress te oerwinnen troch it PACT / PKR-paad te ynhibearjen.Wy observearre dat it nivo fan DARS-AS1-ekspresje posityf korrelearre mei selferset tsjin thapsigargin.SW620 sellen overexpressing DARS-AS1 oerlibbe better doe't behannele mei thapsigargin, wylst sellen mei DARS-AS1 knockdown waarden mear gefoelich (Fig. 4e).Yn oerienstimming mei dizze resultaten fermindere DARS-AS1-overekspresje thapsigargin-induzearre PKR-phosphorylaasje (Supplementary Fig. 4b).Yn tsjinstelling, nei thapsigargin behanneling, PKR en eIF2α waarden phosphorylated yn in hegere mjitte yn DARS-AS1 knockdown sellen fergelike mei kontrôle sellen (oanfoljende Fig. 4b).Ynteressant feroarsake thapsigargin DARS-AS1-ekspresje op in dose-ôfhinklike manier, dy't in anty-stressfunksje fan DARS-AS1 oanjaan kin (Supplementary Fig. 4c).Derneist hawwe wy in vitro aktivearringsassays útfierd om dizze observaasjes te befestigjen.Koartsein, PKR waard suvere út sel lysates mei help fan in anty-PKR antibody, dan ynkubearre mei rekombinante PACT en DARS-AS1 transkribearre in vitro.Nei de enzymatyske reaksje waard phospho-PKR ûntdutsen mei WB.Us resultaten jouwe oan dat PKR-phosphorylaasje signifikant ynhibearre waard troch DARS-AS1, mar net troch kontrôle RNA (figuer 4f).Dizze in vitro en in vivo resultaten suggerearje dat DARS-AS1 PACT-mediated PKR-aktivearring ynhibeart.Tagelyk hawwe wy ek in fermindering fan PACT-herstel observearre yn 'e oanwêzigens fan DARS-AS1 (figuer 4f).Dit resultaat is yn oerienstimming mei de resultaten fan 'e in vitro-proteinbindingsassay (figuer 4c) en wer yllustrearret de blokkearjende funksje fan DARS-AS1 foar PACT-PKR-feriening.
Ser246 en Ser287 yn it D3-domein fan PACT binne ferplicht foar PKR-aktivearring ûnder sellulêre stress.Ferfanging fan twa serine-residuen foar alanine joech mutant PACT (mutD), dy't PKR aktivearre yn 'e ôfwêzigens fan stress, en substitúsje foar alanine (mutA) kearde it protokol.Om't wy it belang fan dit domein hawwe oantoand yn direkte assosjaasje mei DARS-AS1, genereare wy dizze twa PACT-mutanten om te testen oft dizze residuen ek belutsen kinne wurde by ynteraksje mei DARS-AS1.Ynteressant ferlearen beide mutanten de mooglikheid om te binen oan DARS-AS1 (Supplementary Fig. 4d), wat suggerearret dat de folsleine struktuer fan it PACT-protein nedich wêze kin foar effisjinte ynteraksje mei DARS-AS1.
Fierder suggerearje ús resultaten ek dat DARS-AS1-shRNA-induzearre ynhibysje fan selproliferaasje foar in part restaurearre wurde kin troch in dominante negative PACT-mutant (PACTmutA) of in dominante negative PKR-mutant (PKRmut) (Supplementary Fig. 4e. e).Overexpresje fan dominante-negative PKR-mutanten fermindere PKR-phosphorylaasje dy't feroarsake troch DARS-AS1-knockdown en ek eIF2α-phosphorylaasje yn serum-fermindere sellen (Fig. 4g).Noch wichtiger, it oanpart fan apoptotyske sellen dy't troch DARS-AS1-knockdown feroarsake waard, waard ek fermindere yn sellen dy't PKRmut overexpressearje (fig. 4h en Supplementary Fig. 4g).Ynhibysje fan PKR-kinase-aktiviteit beynfloedet ek DARS-AS1-funksje, om't resultaten sjen litte dat DARS-AS1-knockdown selden PKR- en eIF2α-phosphorylaasje feroarsake doe't sellen behannele waarden mei in PKR-spesifike C16-ynhibitor (Fig. 4i en Supplementary Fig. 4h).).Mei-inoar suggerearje ús resultaten dat DARS-AS1 selproliferaasje befoarderet, op syn minst foar in part, troch it ynhiberjen fan PACT-bemiddele PKR-aktivearring.
Om de rol fan DARS-AS1 yn tumorigenesis fierder te ûndersykjen, hawwe wy in vivo eksperiminten útfierd mei in mûs xenograftmodel. Resultaten litte sjen dat knockdown fan DARS-AS1 dramatysk fermindere tumorgroei yn mûzen (p wearde <0.0001) (Fig. 5a). Resultaten litte sjen dat knockdown fan DARS-AS1 dramatysk fermindere tumorgroei yn mûzen (p wearde <0.0001) (Fig. 5a). Resinsjes fan DARS-AS1 binne beskikber foar minsken (oant p <0,0001) (500.000). De resultaten litte sjen dat DARS-AS1 knockdown drastysk ferminderet tumorgroei yn mûzen (p wearde <0.0001) (figuer 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Ûndersiken, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (saint р <0,0001) (5 рис). De resultaten lieten sjen dat DARS-AS1-knockdown tumorgroei yn mûzen signifikant fermindere (p-wearde <0.0001) (figuer 5a).Sa wie d'r yn 'e DARS-AS1 knockdown-groep in signifikante fermindering fan gemiddelde tumorvolumint mei sawat 72.9% en gemiddelde tumormassa mei sawat 87.8% (figuer 5b-d).Dizze resultaten suggerearje sterk dat DARS-AS1 tumorgroei yn vivo signifikant kin befoarderje.
Effekten fan ad DARS-AS1 knockdown op kolorektale onkogenesis yn bleate mûzen.Groeikurven (a), tumorgrutte (b), gewicht (c), en tumorôfbyldings (d) wurde werjûn.Flaterbalken fertsjintwurdigje ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, troch twa-tailed Student syn t test. n = 10. ****p < 0,0001, troch twa-tailed Student syn t test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 twa-tailed Student syn t-test.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 twa-tailed Student's t-test.e Kaplan-Meier analysearre de korrelaasje tusken DARS-AS1 ekspresjenivo's en algemiene oerlibjen yn pasjinten mei UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, en LGG.Hege nivo's fan DARS-AS1-ekspresje yn pasjinten wiene yn 'e top 50%;it lege nivo fan DARS-AS1-ekspresje yn pasjinten wie yn 'e ûnderste 50%.p-wearden waarden bepaald mei de log rank test.f Foarsteld model wêryn DARS-AS1 de PACT-PKR-paad en tumorgroei regelet.
Om de klinyske ynfloed fan DARS-AS1 better te begripen, ûndersochten wy de korrelaasje tusken har ekspresje en it oerlibjen fan pasjinten.Troch it analysearjen fan de TCGA-dataset, fûnen wy dat hegere DARS-AS1-ekspresje ferbûn wie mei uveal melanoma (UVM), renale chromophobia (KICH), renale papillêre selkarsinoom (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Legere oerlibjen wie signifikant assosjearre mei glioblastoma-morfoaze (GBM) en pasjinten mei leechgradige brain-glioma (LGG) (figuer 5e).Dizze resultaten suggerearje dat DARS-AS1 in wichtige rol kin spylje yn klinyske tumorprogression en kin in potinsjele foarsizzende biomarker wêze yn meardere kankers.
Yn dizze stúdzje, mei help fan grutskalige CRISPRI-funksjonele screening, hawwe wy bepaald dat DARS-AS1 lncRNA kankersellenstress oerwint troch twa wichtige stressresponders te regeljen, PACT en PKR.Troch direkt ynteraksje mei PACT, ynhibearre DARS-AS1 PACT-bemiddele PKR-aktivearring, dêrmei foarkommen fan apoptotyske seldea en it befoarderjen fan selproliferaasje (fig. 5f).Upregulation fan DARS-AS1 is waarnommen yn meardere soarten kanker, wat suggerearret dat syn funksje fan it befoarderjen fan kankersellen oerlibjen ûnder stressfolle omstannichheden kin breed fan tapassing wêze op meardere soarten kanker.
PACT is identifisearre as in PKR-aktivatorprotein, en PACT-bemiddele PKR-aktivearring spilet in wichtige rol yn stress-antwurden troch it regulearjen fan transkripsje, oersetting, apoptose, en oare wichtige sellulêre prosessen62.Foar tsientallen jierren binne besocht om de kankerspesifike regeling fan 'e PACT-PKR-kaskade te begripen.Hjir, ús stúdzje die bliken in oar meganisme fan regeling fan PACT-PKR yn kankersellen fia sellulêre lncRNA DARS-AS1, dy't direkt bynt oan PACT, blokkearret PACT-PKR ynteraksje, inhibits PKR aktivearring en eIF2α fosforylaasje, dêrmei inhibiting stress-induzearre apoptosis en it stimulearjen fan eventuele kankerproliferaasje.sellen.Dizze ûntdekking smyt ljocht op potinsjele lncRNA-doelen foar kankerprognose en terapy.
Us gegevens lieten sjen dat DARS-AS1 knockdown sellen sensibilisearje foar serumhonger mei in signifikante ferheging fan phosphorylated PKR en eIF2α.Dizze resultaten suggerearje dat DARS-AS1 it oerlibjen fan kankersellen befoarderet ûnder drege omstannichheden troch PACT / PKR-aktiviteit te ynhiberjen.Ferskate oare net-kodearjende RNA's, lykas ASPACT en nc886, binne ek belutsen by de PACT / PKR-as troch downregulating PACT48 mRNA of regulearjen fan autophosphorylation troch bining oan PKR49,50,64.Under harren fungearret DARS-AS1 as in disruptor fan 'e PACT-PKR-feriening.Dizze stúdzje ferriket ús begryp fan PACT / PKR-asregulaasje en de rol fan lncRNA's yn stress-antwurden.
PACT befettet trije aparte domeinen.Elk fan 'e earste twa dsRBD's is genôch om hege affiniteitsbining fan PACT oan PKR te berikken, wylst it tredde domein (D3) fereaske is foar PKR-aktivearring in vitro en in vivo.Us stúdzje liet sjen dat DARS-AS1 foarkar ynteraksje mei it D3-domein (fig. 3h).Mei it each op de grutte grutte fan it lncRNA (768 nukleotiden), kin DARS-AS1-bining oan D3 de ynteraksje tusken it PACT-domein fan dsRBD en PKR fysyk ynhibearje, en dêrmei de feriening fan PACT en PKR blokkearje.PACT-puntmutaasjes dy't Ser246 en Ser287 yn D3 ferfongen troch alanine of aspartaat, fersteurden syn binende affiniteit foar DARS-AS1, en wiisde op it belang fan D3's algemiene strukturele en elektryske eigenskippen yn har feriening.Fierdere details fan dit meganisme sille nedich wêze yn 'e takomst, mei help fan mear sekuere biogemyske analyze en hege resolúsje PACT strukturele analyze.
Eardere ûndersiken hawwe rapportearre dat DARS-AS1 selproliferaasje befoarderet troch ferskate meganismen51,52,53.Yn ien foarbyld observearre ûndersikers dat DARS-AS1 har antisense-proteïne-kodearjend DARS-gen opregulearre troch te rjochtsjen op miP-194-5p yn nierkankersellen.Yn 'e hjoeddeistige stúdzje hie DARS-AS1-knockdown lykwols net folle effekt op DARS-transkripsje yn meardere soarten kanker, ynklusyf op syn minst kolorektale, boarst- en leverkanker.Om't lncRNA's sel- en weefselspesifike ekspresjepatroanen eksposearje, kinne funksjonele meganismen net bewarre wurde oer kankersoarten, wat kin bydrage oan dizze diskrepânsje tusken ús observaasjes en eardere beoardielingen fan ferskate kankers.Spesjale stúdzjes binne nedich om de spesifike meganismen fan ferskate fysiologyske en patologyske prosessen te ferklearjen.
In analyze fan klinyske gegevens liet sjen dat DARS-AS1-ekspresje yn tumors omkeard korrelearre is mei it fuortbestean fan kankerpasjinten, wat it belang fan 'e DARS-AS1/PACT/PKR-as ûnderstreket yn kankerprognose.As konklúzje lit ús stúdzje sjen dat DARS-AS1 in regulator is fan 'e PACT / PKR-sinjaal-as, proliferaasje fan kankersellen befoarderet en apoptose ynhibeart tidens de stressreaksje, wat in oare line fan ûndersyk leveret en fan belang is foar takomstich ûndersyk nei potinsjele behannelingen .
Minsklike sellenlinen SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 en HEK293T waarden krigen fan 'e National Cell Line Resource Infrastructure yn Sina.Alle sellen waarden bewarre yn DMEM medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) oanfolle mei 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) en 1% penicilline-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) by 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anty-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anty-β-tubulin, CST (2128);normale mûs IgG, CST (5415S);normale rabbit IgG, CST (2729S).Antistoffen waarden verdund 1: 1000 yn PBST foar Western blotting en 1: 100 foar IP.
sgRNA's waarden ûntwikkele mei in iepenbier beskikber ark neamd CRISPR-ERA66.Wy brûkten de standert arkparameters foar sgRNA-ûntwikkeling en it algoritme berekkene sgRNA-binende siden yn 'e 3 kb-regio.sintraal by TSS.Pools fan sgRNA oligonucleotides waarden synthesized by CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) en cloned yn humanisearre pgRNA plasmiden (Addgene #44248).In totaal fan 12 µg fan gearfoege humanisearre pgRNA-plasmide, 7.2 µg fan psPAX2 (Addgene #12260), en 4.8 µg fan pMD2.G (Addgene #12259) waarden ko-transfekteare yn 5 x 106 HEK293T-reagens yn 10 sellen (CWBIO, Peking, Sina) folgje de ynstruksjes fan de fabrikant.Virus-befette supernatanten waarden sammele 48 en 72 oeren nei transfeksje en filtere troch in 0.45 µm filter.Foar screening waarden SW620-sellen dy't it dCas9 / KRAB-fúzjeprotein útdrukke, krigen troch firustransduksje.Modifisearre SW620-sellen waarden ynfekteare mei de firusbibleteek yn fjouwer ûnôfhinklike ynfeksje-eksperiminten op in MOI fan 0.1-0.3 en waarden sampled mei 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) foar 2 dagen.Dêrnei waarden sellen foar 18 dagen yn vitro kweekt mei in minimale biblioteekdekking fan 500 sellen / sgRNA foar screening.
Genomysk DNA waard ekstrahearre neffens de ynstruksjes fan 'e QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Dútslân; 51183).Yn totaal waard 100 μg genomysk DNA per biologyske werhelling brûkt om de biblioteek te bouwen.De sgRNA-regio waard fersterke troch twa rûnen fan PCR en keppele oan in barcode.
PCR-produkten waarden suvere mei NucleoSpin®-gel en PCR-reinigingskit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Dútslân; 740609.250) en kwantifisearre mei Qubit™ HS dûbelstrengige DNA-deteksjekit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
De MTS-assay waard brûkt om selproliferaasje te mjitten.Sellen waarden sied yn 96-well platen by in earste tichtens fan 2000 sellen / well.It relatyf oantal sellen waard deistich mjitten op 'e oantsjutte tiid foar in totaal fan 4-6 dagen.Foar elke boarne waard 20 μl MTS-reagens (Promega) verdund mei 100 μl DMEM, ynkubeare mei sellen foar 4 h op 37 ° C, en dan waard OD490 mjitten.
De kapasiteit foar unanchored groei waard ûntdutsen troch analysearjen fan de formaasje fan sfearen.Koartsein, 2000 sellen transfected mei shRNA DARS-AS1 of kontrôle shRNA waarden yn kultuer brocht yn ultra lege taheaksel mikroplaten (Corning) mei medium feroaring elke 4 dagen.De spheroïden waarden nei 14 dagen teld.500-sellen transfekteare mei it DARS-AS1-overekspresjeplasmide as in kontrôleplasmide waarden brûkt foar de ferbetteringassay, oars wie de metoade net feroare.
RNA waard transkribearre mei T7 RNA-polymerase en biotin-16-UTP (Roche 1138908910) neffens de ynstruksjes fan Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).De hjir brûkte primers steane yn oanfoljende tabel 4.
Protein-kodearjende PACT- as PKR-regio's waarden klone yn pET15b (Addgene #73619) en omfoarme ta BL21 (DE3).De baktearjes waarden oernachtich ynkubeare yn LB levere mei ampicilline en dan 100-fâld verdund mei farske LB.Doe't de OD600 fan it medium 0.8 berikte, waard 1 mM IPTG tafoege om proteïne-ekspresje te inducearjen.Nei ynkubaasje oernachtich mei sêft skodzjen (250 rpm by 20 ° C), waard de selpellet sammele troch sintrifugaasje (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Resuspendearje de selpellet yn lysisbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) en ynkubearje op iis foar 30 min, dan sonicate (15 min, 5 s oan / út, op iis) en sintrifugerje (13.000) rpm)., 30 min, 4°C).De supernatant waard doe laden op Ni-NTA hars (QIAGEN) 3 kear op 4 ° C, wosken 4 kear mei waskbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) en eluearre 3 kear, mei in totaal fan 10 ml eluentbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Purified proteïne waard bepaald mei WB en de konsintraasje waard bepaald mei de Qubit ™ proteïne assay kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-assays waarden útfierd lykas earder beskreaun, mei modifikaasjes.Koartsein, 1x RIP-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease-inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) en sintrifuge by 13.000 rpm foar 15 min by 4 °C.De supernatant waard doe ynkubeare mei proteïne A + G magnetyske kralen (Millipore) konjugearre mei 5 μg anty-PACT antykodym (Abeam) of IgG (CST).De kralen waarden 5 kear wosken mei 5x RIP-buffer, dan digested mei proteinase K (NEB).RNA waard ekstrahearre mei Trizol en bepaald troch RT-qPCR.Primers wurde presintearre yn oanfoljende tabel 5.
De in vitro RIP-assay waard útfierd neffens in wizige standert RIP-assayprotokol.In totaal fan 5 pmol fan in vitro transkribearre RNA waard 1x verdund mei RIP buffer en annealed troch ynkubaasje by 65 ° C foar 5 minuten folge troch stadige koeling nei keamertemperatuer.In totaal fan 5 pmol fan yntakt of mutearre flagge-labele PACT-proteinen waarden suvere fan E. coli.Inkubearje mei renaturearre RNA foar 2 oeren by 4 ° C en folgje de boppesteande proseduere foar RIP-analyse foar anty-flagge IP.
Foar analyse fan RNA-útwreiding waarden 1 × 107-sellen lysearre mei 1xRIP-buffer.Nei centrifugaasje by 13.000 rpm foar 15 min by 4 ° C, waard de supernatant foarbehannele mei 30 μl streptavidin magnetyske kralen (Beckman) foar 2 h by 4 ° C.It suvere lysate waard doe levere mei gist tRNA en ynkubearre mei 40 pmol fan renatured RNA oernacht by 4 ° C, dan foar in oare 2 oeren en 20 μl nije streptavidin magnetyske kralen blokkearre mei BSA waard tafoege.De waskstap bestie út 4 kear mei 5x RIP buffer en 4 kear mei 1x RIP buffer.De oerienkommende aaiwiten waarden eluearre mei biotine-elueringsbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) en skieden op NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Nei sulveren kleurjen (Beyotime Biotechnology) waarden bepaalde bands útsletten en analysearre troch MS.
Co-IP-analyze waard útfierd om de ynteraksje tusken PACT en PKR te testen.Koartsein, supernatant lysates waarden taret troch incubating 1 x 107 lysed sellen yn 1 x RIP buffer folge troch centrifugation by 13.000 rpm foar 15 minuten by 4 ° C.Lysaten waarden laden mei proteïne A + G magnetyske kralen, konjugearre mei 5 µg anty-PACT antykodym, en foarsichtich rotearre oernacht by 4 ° C.De kralen waarden 3 kear wosken mei 5 × RIP buffer, twa kear mei 1 × RIP buffer en eluearre mei 1 × SDS buffer.It weromfûn proteïne waard analysearre troch SDS-PAGE gel en ûntdutsen troch WB.
Twa pmol fan flagge PACT en 1 pmol fan PKR waarden suvere út E. coli.Ferwiderje yn 1 × RIP-buffer en ynkubearje mei 10 pmol renaturearre RNA foar 2 oeren by 4 ° C.Dêrnei waarden se ynkubeare mei proteïne A + G magnetysk bead-konjugearre anty-labele antykody foar in ekstra twa oeren.De kralen waarden dan fjouwer kear wosken mei 1x RIP-buffer en eluearre mei 1x SDS-buffer.De resultearjende PACT en PKR waarden ûntdutsen troch WB.