Nijs

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Enzymatyske proximity-labelingmetoaden basearre op aktivearre esters as fenoksyradikalen wurde in protte brûkt om subsellulêre proteomen en proteïne-ynteraktoaren yn libbene sellen yn kaart te bringen.Aktivearre esters binne lykwols minder reaktyf, wat resulteart yn in brede etiketteringsradius, en fenoksy-radikalen generearre troch peroxide-behanneling kinne ynterferearje mei redoxpaden.Hjir melde wy in metoade foar proximity labeling dependent photoactivation (PDPL) ûntwikkele troch genetysk keppeljen fan it miniSOG fotosensibilisatorprotein oan in proteïne fan belang.Triggered troch blau ljocht en kontrolearre troch eksposysje tiid, singlet soerstof wurdt generearre en dan spatiotemporally oplost labeling fan histidine residuen troch de aniline sonde wurdt berikt.Wy demonstrearje syn hege trou troch organelle-spesifike proteoommapping.In side-by-side ferliking fan PDPL mei TurboID toant in mear spesifike en wiidweidige proteomyske dekking fan PDPL.Dêrnei hawwe wy PDPL tapast op 'e sykte-assosjearre transkripsje-koaktivator BRD4 en E3 Parkin-ligase en fûnen earder ûnbekende ynteraktoaren.Troch oerekspresje-screening waarden twa ûnbekende substraten, Ssu72 en SNW1, identifisearre foar Parkin, waans degradaasje wurdt bemiddele troch de ubiquitinaasje-proteasompaad.
Akkurate karakterisearring fan proteïne netwurken leit oan in protte fûnemintele sellulêre prosessen.Dêrom sil heul krekte spatiotemporale mapping fan proteïne-ynteraksjes in molekulêre basis leverje foar it ûntsiferjen fan biologyske paden, syktepatology, en it fersteuren fan dizze ynteraksjes foar therapeutyske doelen.Foar dit doel binne metoaden dy't by steat binne om tydlike ynteraksjes yn libbene sellen as weefsels te detektearjen heul winsklik.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) is histoarysk brûkt om binende partners fan proteïnen fan belang (POI's) te identifisearjen.Mei de ûntwikkeling fan kwantitative proteomics-metoaden waard Bioplex3.0 makke, de grutste databank fan proteïnetwurken basearre op AP-MS.Hoewol AP-MS heul krêftich is, binne de sellelysis- en verdunningsstappen yn 'e workflow bias foar swakke en transiente binende ynteraksjes en yntrodusearje artefakten nei lysis lykas falske ynteraksjepearen dy't kompartimentalisaasje misse foarôfgeand oan lysis.
Om dizze problemen oan te pakken binne ûnnatuerlike aminosoeren (UAA) mei crosslinkende groepen en enzymatyske plattelânsplatfoarms (PL) ûntwikkele (bgl APEX en BioID)5.Hoewol de UAA-metoade mei súkses is tapast yn in protte senario's en jout ynformaasje oer direkte proteïne-kleefstoffen, is optimisaasje fan 'e UAA-ynfoegje-side noch altyd fereaske.Noch wichtiger, it is in stoichiometryske etiketteermetoade dy't in katalytyske omkearing fan etikettearingseveneminten mist.Yn tsjinstelling, enzymatyske PL-metoaden, lykas de BioID-metoade, fusearje de yngenieurde biotine-ligase oan POI7, dy't dêrnei biotine aktivearret om in reaktive biotinyl-AMP-ester-intermediate te foarmjen.It enzyme katalysearret en jout dus in aktivearre biotine "wolk" út dy't proximale lysine-residuen markearret.BioID fereasket lykwols mear as 12 oeren om in foldwaande markearre sinjaal te krijen, wat it gebrûk mei tydlike resolúsje foarkomt.Troch rjochte evolúsje te brûken basearre op gistwerjefte, waard TurboID ûntworpen op basis fan BioID om effisjinter te wêzen, wêrtroch effisjinte labeling mei biotine binnen 10 minuten mooglik is, wêrtroch mear dynamyske prosessen kinne wurde bestudearre.Om't TurboID heul aktyf is en endogene biotinenivo's genôch binne foar labeling op leech nivo, wurdt eftergrûnlabeling in potinsjele probleem as heul ferbettere en timed labeling fereaske is troch de tafoeging fan exogenous biotine.Dêrnjonken binne aktivearre esters min reaktyf (t1/2 ~5 min), wat kin liede ta in grutte etiketteringsradius, benammen nei sêding fan oanbuorjende aaiwiten mei biotine 5. Yn in oare oanpak, genetyske fúzje fan manipulearre ascorbate peroxidase (ie biotin- fenol radikalen en lit protein labeling binnen ien minute9, 10. APEX wurdt in soad brûkt te identifisearjen subcellular proteomes, membraan protein kompleksen, en cytosolic signaling protein kompleksen 11, 12. Lykwols, de needsaak foar hege konsintraasjes fan peroxides kin beynfloedzje redox aaiwiten of paden, disrupting sellulêre prosessen.
Sa sil in nije metoade dy't yn steat is om mear reaktive ûnderdrukkingsoarten mei markearre radius te generearjen mei hege romtlike en tydlike krektens sûnder sellulêre paden signifikant te fersteuren in wichtige tafoeging oan besteande metoaden. Under de reaktive soarten wekte singlet soerstof ús oandacht fanwege syn koarte libbensdoer en beheinde diffusionstraal (t1/2 <0.6 µs yn sellen)13. Under de reaktive soarten wekte singlet soerstof ús oandacht fanwege syn koarte libbensdoer en beheinde diffusionstraal (t1/2 <0.6 µs yn sellen)13. Среди активных форм наше кимание привлетный кивлетный кислород кислород коротко коротро кограни редискнного радиуса дифффзззии (T1 / 2 <0,6 Мкс в клетках) 13. Under de aktive foarmen luts singlet soerstof ús oandacht troch syn koarte libbensdoer en beheinde diffusionstraal (t1/2 <0.6 µs yn sellen)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6跳庬伕 µﺬ伕 µsﺬ伉 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше кимание привлекает кивлетный кислород кислород кислотко коротро кограни кограничого радиуса дифффззии (T1 / 2 <0,6 Мкс в клетках). Under aktive foarmen lûkt singlet soerstof ús oandacht fanwege syn koarte libbensdoer en beheinde diffusionsradius (t1/2 <0,6 μs yn sellen).Singlet soerstof is rapportearre om willekeurich methionine, tyrosine, histidine en tryptofan te oksidearjen, wêrtroch it polar 14,15 is foar hechting oan amine of thiol basearre probes16,17.Hoewol singlet soerstof is brûkt om RNA fan subsellulêre kompartmint te labeljen, bliuwe strategyen foar it werjaan fan endogene POI-njonkenmarkers net ûndersocht.Hjir presintearje wy in platfoarm neamd photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), wêr't wy blau ljocht brûke om POI's fusearre mei in miniSOG fotosensibilisator te ferljochtsjen en singlet soerstofgeneraasje te triggerjen om proksimale resten te oksidearjen, folge troch amine-befette modifikaasjes om gemyske probes te oksidearjen yn tuskenlizzende libbene sellen..Wy testen in groep gemyske probes om tagspesifisiteit te maksimalisearjen en identifisearre modifikaasjesites mei in iepen proteomics-workflow.In side-by-side ferliking fan PDPL mei TurboID toant in mear spesifike en wiidweidige proteomyske dekking fan PDPL.Wy hawwe dizze oanpak tapast op organelle-spesifike markers fan it subsellulêre proteoom en algemiene proteoomidentifikaasje fan binende partners foar it kanker-assosjearre epigenetyske regulearjende proteïne BRD4 en de Parkinson-sykte-assosjearre E3-ligase Parkin, dy't sawol in bekend as in ûnbekend netwurk fan proteïne befêstige. ynteraksjes..It fermogen fan PDPL om E3-substraten te erkennen yn grutte proteïnekompleksen fertsjintwurdiget in situaasje dêr't erkenning fan yndirekte binders nedich is.Twa ûnbekende parkin-substraten bemiddele troch ubiquitinaasje-proteasom binne yn situ befêstige.
Fotodynamyske terapy (PDT)19 en chromofoor-assistearre laser-ynaktivaasje (CALI)20, wêrby't ljochtbestraling mei fotosensibilisatoren singlet soerstof genereart, kin doelproteinen ynaktivearje of sels dea feroarsaakje.Sûnt singlet soerstof is in tige reaktive stof mei in teoretyske diffusion ôfstân fan likernôch 70 nm, romtlik beheinde oksidaasje fan de fotosensibilisator kin wurde kontrolearre.Op grûn fan dit konsept hawwe wy besletten singlet soerstof te brûken om nauwe etikettering fan proteïnekompleksen yn libbene sellen te berikken.Wy hawwe in PDPL-chemoproteomyske oanpak ûntwikkele om fjouwer funksjes te ferfoljen: (1) om de generaasje fan aktive singlet soerstof te katalysearjen fergelykber mei de PL-enzymatyske oanpak;(2) jouwe tiid-oplost labeling by ljocht inisjatyf;(3) troch feroaring (4) Foarkom it brûken fan endogene kofaktoren (lykas biotine) om eftergrûn te ferminderjen, of brûk heul fersteurende eksogene reagenzjes (lykas peroxides) om sel bleatstelling oan miljeu-stress te minimalisearjen.
Fotosensibilisatoren kinne wurde ferdield yn twa kategoryen, ynklusyf fluorofoaren mei lyts molekulêr gewicht (bgl. rose Bengal, methylene blau)22 en genetysk kodearre lytse aaiwiten (bgl. miniSOG, KillerRed)23.Om in modulêr ûntwerp te berikken, hawwe wy it earste generaasje PDPL-platfoarm ûntwikkele troch fotosensibilisator (PS) proteïnen ta te foegjen oan POI24,25 (figuer 1a).Wannear't bestraling mei blau ljocht, singlet soerstof oxidizes proximal nucleophilic amino acid residuen, resultearret yn in umpolung polariteit dat is electrophilic en kin fierder reagearje mei amine probe nucleophiles16,17.De sonde is ûntworpen mei in alkynhandgreep om klikkchemie mooglik te meitsjen en del te lûken foar LC / MS / MS-karakterisaasje.
Skematyske yllustraasje fan labeling fan proteïnekompleksen bemiddele troch miniSOG.By bleatstelling oan blau ljocht generearje sellen dy't miniSOG-POI ekspresje, singlet soerstof, dy't ynteraktive aaiwiten feroaret, mar net net-binende aaiwiten.Tussenprodukten fan fotooxidaasje wurde ûnderskept troch estafetteetiketten fan 'e amine gemyske sonde om kovalente addukten te foarmjen.De alkynylgroep op 'e chemiesonde makket klikchemie mooglik foar ferriking troch pull-down folge troch LC-MS / MS-kwantifikaasje.b Gemyske struktuer fan amine probes 1-4.c Representative fluorescent gel-analyze fan mitochondriale lokalisearre miniSOG-bemiddele proteomyske markers mei probes 1-4 en relative kwantifikaasje basearre op geldensitometry.De sinjaal-to-eftergrûnferhâlding fan gemyske probes waard beoardiele mei negative kontrôle eksperiminten útsein blau ljocht of mei HEK293T-sellen sûnder miniSOG-ekspresje.n = 2 biologysk ûnôfhinklike samples.Elke stip stiet foar in biologyske replika.d Represintative deteksje en kwantifikaasje fan PDPL mei optimisearre sonde 3 yn 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan' e oantsjutte PDPL-komponinten lykas c.n = 3 biologysk ûnôfhinklike samples.Elke stip stiet foar in biologyske replika.Centerlines en whiskers fertsjintwurdigje de gemiddelde en ± standertdeviaasje.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal imaging fan singlet soerstof mei far-read Si-DMA stain.Skaalbalke: 10 µm.Gel-ôfbylding en konfokale eksperiminten waarden op syn minst twa kear ûnôfhinklik werhelle mei ferlykbere resultaten.
Wy ûndersochten earst it fermogen fan 'e ripe fotosensibilisatoren miniSOG26 en KillerRed23, stabyl útdrukt yn HEK293T, om propargylamine-labeling fan' e proteoom te bemiddeljen as in gemyske probe (Supplementary Fig. 1a).Gelfluorescence-analyze liet sjen dat de hiele proteome-labeling waard berikt mei miniSOG en bestraling fan blau ljocht, wylst gjin sichtber etiketteprodukt waard waarnommen mei KillerRed.Om de sinjaal-eftergrûnferhâlding te ferbetterjen, testen wy doe in set gemyske probes dy't aniline (1 en 3), propylamine (2), of benzylamine (4) befetsje.Wy observearre dat HEK293T-sellen sels in hegere eftergrûnsinjaal hienen yn ferliking mei gjin blau ljocht, mooglik troch de endogenous riboflavin-fotosensibilisator, flavin mononucleotide (FMN) 27. Aniline-basearre gemyske probes 1 en 3 joegen bettere spesifisiteit, mei HEK293T stabyl ekspresje miniSOG yn mitochondria dy't in > 8-fâldige ferheging fan sinjaal foar probe 3 werjaan, wylst probe 2 brûkt yn 'e RNA-labelmetoade CAP-seq allinich ~2.5- werjaan fold sinjaal ferheging, wierskynlik fanwege ferskillende reaktiviteit foarkar tusken RNA en protein (Fig. 1b, c). Aniline-basearre gemyske probes 1 en 3 joegen bettere spesifisiteit, mei HEK293T stabyl ekspresje miniSOG yn mitochondria dy't in > 8-fâldige ferheging fan sinjaal foar probe 3 werjaan, wylst probe 2 brûkt yn 'e RNA-labelmetoade CAP-seq allinich ~2.5- werjaan fold sinjaal ferheging, wierskynlik fanwege ferskillende reaktiviteit foarkar tusken RNA en protein (Fig. 1b, c).Aniline-basearre gemyske probes 1 en 3 lieten bettere spesifisiteit sjen: HEK293T, dy't stabile miniSOG yn mitochondria útdrukt, toant mear as in 8-fâldige ferheging fan sinjaal foar probe 3, wylst probe 2, brûkt yn 'e CAP-seq RNA-labelmetoade, allinich toant ~ 2.5-fold sinjaal ferheging, wierskynlik troch ferskillende reaktiviteit foarkar tusken RNA en protein (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 更 更 好 特异性 特异性 粒体 表达 MINISOG, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 RNA 标记 方法 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 具有 的 特异性, Hek293T 在 粒体 中 稳定 表达 MINISOG, 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAAniline-basearre gemyske probes 1 en 3 hiene bettere spesifisiteit, HEK293T stabilisearre miniSOG yn mitochondria, en probe 3 hie mear dan 8-fâldige ferheging fan sinjaal, wylst probe 2 foar de CAP-seq RNA-labelmetoade allinich ~ 2.5-fold ferheging toande.yn it sinjaal, wierskynlik troch ferskillende reaksje foarkar tusken RNA en aaiwyt (Fig. 1b, c).Dêrnjonken waarden probe 3-isomers en hydrazine-probes (probes 5, 6, 7) hifke, befêstigje de optimisaasje fan probe 3 (Supplementary Fig. 1b, c).Lykas, yn-gel fluorescence analyze die bliken oare optimalisearre eksperimintele parameters: irradiation golflingte (460 nm), gemyske probe konsintraasje (1 mM), en irradiation tiid (20 min) (Supplementary Fig. 2a-c).It fuortlitten fan elke komponint of stap yn it PDPL-protokol resultearre yn signifikante sinjaalomkearing nei de eftergrûn (Fig. 1d).Opmerklik waard proteïne-labeling signifikant fermindere yn 'e oanwêzigens fan natriumazide of trolox, dy't bekend binne om singlet soerstof te blussen.De oanwêzigens fan D2O, dy't bekend is om singlet soerstof te stabilisearjen, fersterket it etiketteringssinjaal.Om de bydrage fan oare reaktive soerstofsoarten oan labeling te ûndersykjen, waarden mannitol en fitamine C tafoege om respektivelik hydroxyl- en superoxide radikale scavengers te fêstigjen, 18, 29, mar se waarden net fûn om labeling te ferminderjen.Tafoeging fan H2O2, mar net ferljochting, resultearre net yn labeling (Supplementary Fig. 3a).Fluorescence singlet soerstof imaging mei Si-DMA sondes befêstige de oanwêzigens fan singlet soerstof yn de HEK293T-miniSOG tried, mar net yn de oarspronklike HEK293T tried.Dêrneist mitoSOX Red koe net detect superoxide produksje nei ferljochting (Fig. 1e en Supplementary Fig. 3b) 30. Dizze gegevens sterk suggerearje dat singlet soerstof is de wichtichste reaktive soerstof soarten ferantwurdlik foar folgjende proteomic labeling.Cytotoxicity fan PDPL waard beoardiele ynklusyf blauwe ljocht irradiation en gemyske probes, en gjin signifikante cytotoxicity waard waarnommen (Supplementary Fig. 4a).
Om it labelmeganisme te studearjen en proteomyske identifikaasje fan proteïnekompleksen mooglik te meitsjen mei LC-MS / MS, moatte wy earst bepale hokker aminosoeren wurde wizige en de deltamassa fan probe-etiketten.Methionine, histidine, tryptofan en tyrosine binne rapportearre om wizige te wurden troch singlet oxygen14,15.Wy yntegrearje de TOP-ABPP31-workflow mei de ûnbidige iepen sykopdracht levere troch it FragPipe-komputerplatfoarm basearre op MSFragger32.Nei modifikaasje fan singlet soerstof en labeling fan gemyske probe, waard klikchemie útfierd mei in biotine-reduksje-label mei in knipbere linker, folge troch neutravidine-stretsjen en trypsindigestion.It modifisearre peptide, noch bûn oan it hars, waard photocleaved foar LC-MS / MS-analyze (figuer 2a en oanfoljende gegevens 1).In grut oantal modifikaasjes barde yn 'e proteome mei mear as 50 peptide map (PSM) wedstriden neamd (Fig. 2b).Ferrassend hawwe wy allinich modifikaasje fan histidine waarnommen, wierskynlik troch de hegere reaktiviteit fan oksidearre histidine nei anilineprobes dan oare aminosoeren.Neffens it publisearre meganisme fan histidine-oksidaasje troch singlet soerstof, 21,33 komt de foarstelde delta-massastruktuer fan +229 Da oerien mei it addukt fan probe 3 mei 2-oxo-histidine nei twa oksidaasjes, wylst +247 Da it hydrolyseprodukt is fan +229 Da (oanfoljende figuer 5).De evaluaasje fan it MS2-spektrum toande in hege betrouberens fan identifikaasje fan de measte fan 'e y- en b-ionen, ynklusyf de identifikaasje fan feroare fragmintionen (y en b) (fig. 2c).Kontekstanalyze fan 'e pleatslike folchoarder fan PDPL-modifisearre histidines die bliken in matige motyf foarkar foar lytse hydrofobe residuen op ± 1 posysjes (Supplementary Fig. 4b).Yn trochsneed waarden 1.4 histidines per proteïne identifisearre, en de plakken fan dizze markers waarden bepaald troch solvent tagonklik oerflak (SASA) en relative solvent beskikberens (RSA) analyze (Supplementary Fig. 4c, d).
In unbiased workflow foar it bestudearjen fan residuele selektiviteit mei it FragPipe-komputerplatfoarm oandreaun troch MSFragger.Cleavable linkers wurde brûkt yn Click skiekunde te tastean photocleavage fan feroare peptiden út streptavidin hars.In iepen sykopdracht waard lansearre om ferskate oanpassingen te identifisearjen, lykas relevante oerbliuwsels.b Tawize de massa oan feroarings dy't yn it proteoom foarkomme.Peptide mapping PSM.c MS2 spektrale annotaasje fan histidine sites modifisearre mei probe 3. As in represintatyf foarbyld, in kovalente reaksje mei probe 3 tafoege +229.0938 Da oan de feroare amino acid.d Mutaasje-assay brûkt om te testen foar PDPL-markers.PRDX3 (H155A, H225A) en PRDX1 (H10A, H81A, H169A) waarden transfektearre mei wyldtype plasmiden foar anty-flaggedeteksje.e.f In vitro proteïne-nei-proteïne-ynteraksjes modeleare mei miniSOG-6xHis-tag en anty-6xHis antykodym.Antibiotine (streptavidin-HRP) en anty-mûs Western blot-analyze fan miniSOG-6xHis/anti-6xHis antykodykompleksjes markearre mei probe 3, ôfhinklik fan 'e tiid fan bleatstelling oan ljocht.Etiketten foar yndividuele aaiwiten wurde útdrukt yn it korrespondearjende molekulêre gewicht: LC antibody lichte keten, HC antibody swiere keten.Dizze eksperiminten waarden ûnôfhinklik op syn minst twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.
Foar biogemyske ferifikaasje fan 'e labelingside, PRDX3 en PRDX1 identifisearre troch massaspektrometry waarden feroare fan histidine nei alanine en fergelike mei wyldtype yn transfeksje-assays.De PDPL resultaten lieten sjen dat de mutaasje signifikant fermindere labeling (Fig. 2d).Underwilens waarden de peptidesekwinsjes identifisearre yn 'e iepen sykopdracht synthesisearre en reagearre yn vitro mei suvere miniSOG yn' e oanwêzigens fan probe 3 en blau ljocht, wêrtroch produkten mei in massaferskowing fan +247 en +229 Da wurde ûntdutsen troch LC-MS (Fig. 2e).).Om te testen oft ynteraktyf proximale proteïnen yn vitro kinne wurde markearre yn reaksje op miniSOG-fotoaktivearring, ûntworpen wy in keunstmjittige proximity-assay troch ynteraksje tusken it miniSOG-6xHis-protein en in anty-His monoklonaal antykodyk in vitro (figuer 2f).Yn dizze assay ferwachten wy proximale labeling fan antybody swiere en lichte keatlingen mei miniSOG.Yn feite, anty-mûs (erkenning fan 'e swiere en lichte keatlingen fan anty-6xHis-labele antykodym) en streptavidin Western blots toande sterke biotinylaasje fan' e swiere en lichte keatlingen.Opmerklik hawwe wy miniSOG-autobiotinylaasje opmurken troch de 6xHis-tag en cross-links tusken ljochte en swiere keatlingen, dy't relatearre wurde kinne oan it earder beskreaune gat tusken lysine en 2-oxo-histidine proximale antwurd.As konklúzje konkludearje wy dat PDPL histidine feroaret op in proximity-ôfhinklike manier.
Us folgjende doel wie om it subcellulêre proteoom te karakterisearjen om de spesifisiteit fan in situ-labeling te testen.Dêrom hawwe wy miniSOG stabyl útdrukt yn 'e kearn, mitochondriale matrix, of bûten ER-membraan fan HEK293T-sellen (Fig. 3a).Gel fluorescence analyze die bliken oerfloedich markearre bands op trije subcellular lokaasjes likegoed as ferskillende labeling patroanen (Fig. 3b).Fluorescence imaging analyze toande hege spesifisiteit fan PDPL (Fig. 3c).De PDPL-workflow waard folge troch klikreaksjes mei rhodamine-kleurstoffen om subzellulêre proteomen te definiearjen mei fluoreszensmikroskopie, en PDPL-sinjalen waarden kolokalisearre mei DAPI, mitochondriale trackers, of ER-trackers, befêstigje de hege fidelity fan PDPL.Foar de trije organellelokaasjes liet in side-by-side ferliking fan PDPL mei TurboID mei avidin western blot sjen dat PDPL mear spesifyk markearre waard yn ferliking mei har respektive kontrôles.Under PDPL-betingsten ferskynden mear markearre bands, wat mear PDPL-markearre aaiwiten oanjout (oanfoljende Fig. 6a-d).
in skematyske fertsjintwurdiging fan miniSOG-bemiddele organelle-spesifike proteome-labeling.miniSOG rjochtet de mitochondriale matrix fia fúzje nei de N-terminale 23 aminosoeren fan minsklike COX4 (mito-miniSOG), de kearn fia fúzje nei H2B (nucleus-miniSOG), en Sec61β fia de cytoplasmyske kant fan it ER-membraan (ER-miniSOG) ).Yndikaasjes omfetsje gelôfbylding, konfokale ôfbylding, en massaspektrometry.b Representative gelôfbyldings fan trije organelle-spesifike PDPL-profilen.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Fertsjintwurdige konfokale ôfbyldings fan HEK293T-sellen dy't miniSOG stabyl útdrukke mei ferskate subsellulêre lokalisaasjes ûntdutsen troch antykodyk markearre V5 (read).Subcellulêre markers wurde brûkt foar mitochondria en ER (grien).De PDPL-workflow omfettet de deteksje fan miniSOG (giel) markearre subsellulêre proteomen mei Cy3-azide-klikkemy.Skaalbalke: 10 µm.d Volkanyske plots fan PDPL-tagged proteomen yn ferskate organellen kwantifisearre troch unlabeled kwantifikaasje (n = 3 ûnôfhinklike biologyske eksperiminten).Twa-tailed Student syn t-test waard brûkt op fulkaan plots.HEK293T wylde type waard brûkt as in negative kontrôle. Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en> 2-fold ion yntinsiteit ferskil). Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en> 2-fold ion yntinsiteit ferskil). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en >2-кратная разница yn интенсивности ионов). Wichtich feroare proteïnen wurde yn read markearre (p <0.05 en> 2-fold ferskil yn ionintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные выделены красным цветом (p < 0,05 en > 2-кратная разница yn ионной силе). Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en > 2-fold ferskil yn ionyske sterkte).Besibbe aaiwiten wichtich foar HEK293T-miniSOG mar net wichtich foar HEK293T wurde yn grien werjûn.e Analyse fan 'e spesifisiteit fan proteomyske datasetten út eksperiminten d.It totale oantal statistysk signifikante aaiwiten yn elke organelle (reade en griene stippen) is oan 'e boppekant markearre.Histograms toane aaiwiten lokalisearre yn organellen basearre op MitoCarta 3.0, GO analyze en A. Ting et al.folk.Separate datasets foar mitochondria, kearnen, en ER.Dizze eksperiminten waarden ûnôfhinklik op syn minst twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
Oanmoedige troch de gel- en ôfbyldingsresultaten waard labelfrije kwantifikaasje brûkt om it identifisearre proteoom yn elke organelle te kwantifisearjen (oanfoljende gegevens 2).Untransfektearre HEK293T waard brûkt as in negative kontrôle om eftergrûnmarkers ôf te lûken. Fulkaanplotanalyse toande signifikant ferrike aaiwiten (p <0.05 en> 2-fold ionintensiteit) en ek singletonproteinen dy't allinich oanwêzich binne yn miniSOG-útdrukkingslinen (Fig. 3d reade en griene stippen). Fulkaanplotanalyse toande signifikant ferrike aaiwiten (p <0.05 en> 2-fold ionintensiteit) en ek singletonproteinen dy't allinich oanwêzich binne yn miniSOG-útdrukkingslinen (Fig. 3d reade en griene stippen). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Fulkaanplotanalyse liet signifikant ferrike aaiwiten sjen (p<0.05 en>2-fâldige ionintensiteit) en ek inkele aaiwiten dy't allinich oanwêzich binne yn miniSOG-útdrukkingslinen (Fig. 3d, reade en griene stippen).火山图 分析 显示 出 显着 富集 富集 富集 蛋白质 (P <0,05 和> 2 倍倍 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (图 3d 红色 和 绿色点).火山图 分析 显示 出 显着 的 的 的 (P <0,05 和> 2 倍倍 强度 MINISOG 表达 存 的 在于 蛋白质 (图 3D 红色 绿色点 ...))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Fulkaanplot-analyze die bliken signifikant ferrike proteïnen (p<0.05 en>2x ionyske sterkte) en ek inkele proteïnen allinich oanwêzich yn 'e miniSOG-ekspresjeline (reade en griene punten yn Fig. 3d).Troch dizze gegevens te kombinearjen identifisearren wy respektivelik 1364, 461 en 911 statistysk signifikante nukleêre, mitochondriale en ER bûtenmembraanproteinen.Om de krektens fan organelle-lokalisearre PDPL te analysearjen, brûkten wy MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analyze, en A. Ting et al.in gegevensset8 waard brûkt foar mitochondria, kearn en ER om de organelle-spesifisiteit fan 'e ûntdutsen proteïnen te testen, oerienkommende mei in krektens fan 73.4, 78.5 en 73.0% (fig. 3e).De spesifisiteit fan PDPL befestiget dat PDPL in ideaal ark is foar it identifisearjen fan organelle-spesifike proteomen.Opmerklik hat submitochondriale analyze fan identifisearre mitochondriale proteïnen sjen litten dat it opsletten proteoom benammen ferdield waard yn 'e matrix en ynderlike membraan (226 en 106, respektivelik), goed foar 91.7% (362) fan it totale oantal identifisearre mitochondriale proteïnen.in heech nivo fan PDPL waard boppedat befêstige (Supplementary Fig. 7a).Likegoed liet subnukleêre analyze sjen dat it finzene proteoom benammen ferdield waard yn 'e kearn, nukleoplasma en nukleolus (Supplementary Fig. 7b).Nuclear proteomic analyze mei in nukleêre lokalisaasje sinjaal peptide (3xNLS) toande ferlykbere krektens oan de H2B konstruksje (Supplementary Fig. 7c-h).Om de spesifisiteit fan 'e PDPL-marker te bepalen, waard nukleêre laminin A keazen as in mear diskrete lokalisearre POI7-fal.PDPL identifisearre 36 signifikant ferrike aaiwiten, wêrfan 12 aaiwiten (30.0% ynklusyf lamin A) wiene goed karakterisearre lamin A ynteraksje aaiwiten annotearre troch de String databank, mei in heger persintaazje as de BioID metoade (122 aaiwiten) 28 fan 28. , 22.9 %) 7. Us metoade identifisearre minder aaiwiten, mooglik fanwege beheinde labeling gebieten, dat waard mooglik makke troch mear aktive singlet soerstof.GO-analyze liet sjen dat de identifisearre aaiwiten benammen yn it nukleoplasma (26), nukleêre membraan (10), nukleêre membraan (9), en nukleêre poaren (5) lizze.Mei-elkoar hawwe dizze nukleêre-lokalisearre aaiwiten 80% fan 'e ferrike aaiwiten ferantwurde, wat de spesifisiteit fan PDPL fierder oantoand (Supplementary Fig. 8a-d).
Nei it fêststellen fan it fermogen fan PDPL om proximity-markearring yn organellen út te fieren, testen wy dan oft PDPL koe wurde brûkt om POI-binende partners te analysearjen.Yn it bysûnder sochten wy PDPL-analyze fan cytosolyske proteïnen te definiearjen, dy't wurde beskôge as dreger doelen dan har membraan-lokalisearre tsjinhingers fanwege har heul dynamyske aard.It bromodomain en extraterminal (BET) proteïne BRD4 hat ús oandacht lutsen foar syn wichtige rol yn ferskate sykten 35, 36.It kompleks foarme troch BRD4 is in transkripsje-koaktivator en in wichtich therapeutysk doel.Troch it regulearjen fan de ekspresje fan c-myc en Wnt5a-transkripsjefaktoaren, wurdt tocht dat BRD4 in wichtige determinant is fan akute myeloïde leukemy (AML), multiple myeloma, Burkitt's lymphoma, kolonkanker en inflammatoare sykten37,38.Derneist rjochtsje guon firussen op BRD4 om virale en sellulêre transkripsje te regulearjen, lykas papillomavirus, HIV, en SARS-CoV-236,39.
Om de BRD4-ynteraksje yn kaart te bringen mei PDPL, kombineare wy miniSOG mei in koarte N- of C-terminal isofoarm fan BRD4.Proteomyske resultaten lieten in hege mjitte fan oerlaap sjen tusken de twa konstruksjes (Supplementary Fig. 9a).It nukleêre proteoom identifisearre mei miniSOG-H2B beslacht 77.6% fan 'e aaiwiten dy't ynteraksje mei BRD4 (Supplementary Fig. 9b).Dêrnei waarden ferskate tiden fan ferljochting (2, 5, 10, 20 min) brûkt om de markerradius oan te passen (Fig. 4a en oanfoljende gegevens 3).Wy konkludearje dat by koartere fotoperioden PDPL primêr direkte binende partners sil markearje, wylst langere perioaden proteïnen sille omfetsje dy't identifisearre binne tidens koartere fotoaktivearringsperioaden, lykas yndirekte doelen yn labelingkompleksen.Yn feite fûnen wy sterke oerlaap tusken neistlizzende tiidpunten (84,6% foar 2 en 5 min; 87,7% foar 5 en 10 min; 98,7% foar 10 en 20 min) (fig. 4b en oanfoljende Fig. 9c).Yn alle eksperimintele groepen fûnen wy net allinich BRD4 sels-labeling, mar ferskate bekende doelen lykas MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, en HMGB1 annotearre yn 'e string databank.De ionyske krêft fan dizze doelen is evenredich mei de eksposysjetiid (figuer 4c en oanfoljende figuer 9d).GO-analyze fan 'e aaiwiten identifisearre yn' e 2-minuten groep liet sjen dat de identifisearre aaiwiten waarden lokalisearre yn 'e kearn en wiene belutsen by chromatine remodeling en RNA polymerase funksje.De molekulêre funksje fan it aaiwyt waard ferrike yn chromatine binding of transkripsjonele coactivation, konsekwint mei BRD4 funksje (Fig. 4d).String-database-ynskeakele proteïne-ynteraksje-analyze die bliken in earste nivo fan yndirekte ynteraksjes tusken BRD4 en HDAC famylje ynteraksje kompleksen lykas SIN3A, NCOR2, BCOR, en SAP130 (Fig. 4e en Oanfoljende Fig. 9e), yn oerienstimming mei BRD4 en HDAC binende acetylated histones ..Dêrnjonken waarden represintative doelen identifisearre troch LC-MS / MS, ynklusyf Sin3A, NSUN2, Fus en SFPQ, befêstige troch Western blotting (fig. 4f).Koartlyn is de koarte isofoarm fan BRD4 rapportearre om kearnen te foarmjen mei floeistof-flüssige faze-skieding (LLPS) eigenskippen.De RNA-binende proteïnen Fus en SFPQ bemiddelje de LLPS fan ferskate sellulêre prosessen en binne hjir identifisearre as net opnommen BRD4-binende proteïnen.De ynteraksje tusken BRD4 en SFPQ waard befêstige troch co-immunoprecipitaasje (co-IP) eksperiminten (figuer 4g), wat suggerearret in oare meganisme foar BRD4-mediated floeistof-floeistof faze skieding dy't fertsjinnet fierder ûndersyk.Mei-inoar suggerearje dizze resultaten dat PDPL in ideaal platfoarm is foar it identifisearjen fan bekende BRD4-ynteraksje en ek ûnbekende binende aaiwiten.
in skematyske foarstelling fan miniSOG-bemiddele BRD4-njonkenmarkearring, eksposysjetiden: 2, 5, 10 en 20 min.b Oerlaap fan aaiwiten identifisearre op ferskillende ferljochting tiden.Proteinferriking identifisearre yn HEK293T-miniSOG-BRD4 wie statistysk signifikant yn ferliking mei wyldtype HEK293T.c Ionintensiteit by it kwantifisearjen fan unlabele fertsjintwurdiger bekende BRD4-binende aaiwiten tidens de opjûne eksposysjetiid.n = 3 biologysk ûnôfhinklike samples.Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± standertdeviaasje.d Gene ontologyske analyze (GO) fan proteïnen identifisearre yn 'e 2-minute groep.De earste tsien GO-termen wurde neamd.Bubbles wurde kleurd neffens de GO term kategory, en bubble grutte is evenredich mei it oantal aaiwiten fûn yn elke term.e Stringanalyse fan proteïnen dy't ynteraksje mei BRD4.De giele sirkels binne direkte lijm en de grize sirkels binne de earste laach fan yndirekte lym.De reade linen fertsjintwurdigje de eksperiminteel bepaalde ynteraksjes en de blauwe linen fertsjintwurdigje de foarseine ynteraksjes.f Representative BRD4 binende doelen identifisearre yn LC-MS / MS waarden ferifiearre troch Western blotting.g Co-immunoprecipitaasje eksperiminten befêstigje de ynteraksje tusken SFPQ en BRD4.Dizze eksperiminten waarden ûnôfhinklik op syn minst twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
Neist it identifisearjen fan net-registrearre POI-assosjearre doelen, hypoteze wy dat PDPL geskikt sil wêze foar it identifisearjen fan substraten foar enzymen, wat de karakterisearring fan yndirekte binende aaiwiten yn grutte kompleksen soe fereaskje om net-registrearre substraten te annotearjen.Parkin (kodearre troch PARK2) is in E3-ligase en mutaasjes yn parkin binne bekend om autosomale recessive juvenile sykte fan Parkinson (AR-JP)42 te feroarsaakjen.Derneist is parkin beskreaun as essensjeel foar mitofagy (mitochondriale autofagy) en it fuortheljen fan reaktive soerstofsoarten.Hoewol, hoewol ferskate parkin-substraten binne identifisearre, bliuwt de rol fan parkin yn dizze sykte ûndúdlik.Om har unkarakterisearre substraten te annotearjen, waard PDPL hifke troch miniSOG ta te foegjen oan 'e N- of C-terminus fan parkin.Sellen waarden behannele mei de karbonylcyanide protontransporter m-chlorophenylhydrazon (CCCP) om parkin te aktivearjen fia de PINK1-Parkin-paad.Yn ferliking mei ús BRD4 PDPL-resultaten iepenbiere parkin N-terminus-fúzje in gruttere set fan doelproteinen, hoewol it in grutter diel fan 'e C-terminus besloech (177 fan 210) (figuer 5a,b en oanfoljende gegevens 4).it resultaat komt oerien mei rapporten dat N-terminal tags Parkin44 ôfwikend kinne aktivearje.Ferrassend wiene d'r mar 18 oerlappende proteïnen yn ús gegevens mei publisearre AP-MS-resultaten foar Parkin43, wierskynlik troch ferskillen tusken sellinen en proteomika-workflows.Neist fjouwer bekende aaiwiten (ARDM1, HSPA8, PSMD14, en PSMC3) identifisearre troch twa metoaden (Fig. 5c) 43.Om de resultaten fan LC-MS / MS fierder te validearjen, waarden PDPL-behanneling en folgjende Western blotting brûkt om de resultaten te fergelykjen fan 'e HEK293T-âldersel-assay en de stabile N-terminale parkinline.Earder ûnbekende doelen CDK2, DUT, CTBP1 en PSMC4 waarden hifke mei in bekende bynmiddel, DNAJB1 (fig. 5d).
Fulkaanplot fan parkin-ynteragearjende proteïnen yn HEK293T-sellen mei stabyl útdrukte miniSOG fusearre oan 'e N- of C-terminus fan parkin (n = 3 ûnôfhinklike biologyske eksperiminten).Twa-tailed Student syn t-test waard brûkt op fulkaan plots.HEK293T waard brûkt as in negative kontrôle. Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en> 2-fold ion yntinsiteit ferskil). Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en> 2-fold ion yntinsiteit ferskil). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en >2-кратная разница yn интенсивности ионов). Wichtich feroare proteïnen wurde yn read markearre (p <0.05 en> 2-fold ferskil yn ionintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные выделены красным цветом (p < 0,05 en > 2-кратная разница yn ионной силе). Signifikant feroare aaiwiten wurde markearre yn read (p <0.05 en > 2-fold ferskil yn ionyske sterkte).Besibbe aaiwiten wichtich foar HEK293T-miniSOG mar net wichtich foar HEK293T wurde yn grien werjûn.b Venn diagram mei oerlappende aaiwiten tusken N-terminal en C-terminal konstruksjes.N-terminal tags kinne parkin ôfwikend aktivearje en resultearje yn mear werkenbere aaiwiten.c Venn-diagram dat oerlappende aaiwiten sjen lit tusken PDPL en AP-MS.Bekende ynteraktoaren wurde neamd, ynklusyf 4 fan 18 oerlappende aaiwiten en 11 fan 159 aaiwiten spesifyk identifisearre yn PDPL.d Representative doelen identifisearre troch LC-MS / MS waarden ferifiearre troch Western blotting.e Ssu72 en SNW1 waarden identifisearre as net-registrearre parkin-substraten.Dizze FLAG-tagged proteïneplasmiden waarden transfekteare yn HEK293T en HEK293T-Parkin-miniSOG folge troch CCCP-behanneling op ferskate tiidpunten.De degradaasje wie mear útsprutsen yn 'e Parkin-overekspresjeline.f Mei help fan de proteasominhibitor MG132, waard befêstige dat it degradaasjeproses fan Ssu72 en SNW1 wurdt bemiddele troch proteasome-ubiquitinaasje.Dizze eksperiminten waarden ûnôfhinklik op syn minst twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
Opmerklik moatte de proteïnen identifisearre troch PDPL parkin-binende proteïnen en har substraten omfetsje.Om net-registrearre parkin-substraten te detektearjen, selekteare wy sân identifisearre proteïnen (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 en SNW1) en transfekteare plasmiden om dizze genen te eksposearjen oan normale HEK293T en stabyl ekspresje miniSOG-Parkin's behanneling folge troch HEK293T.De nivo's fan Ssu72- en SNW1-proteinen waarden signifikant fermindere yn 'e stabile miniSOG-Parkin-line (Fig. 5e).Behanneling mei CCCP foar 12 oeren resultearre yn de meast wichtige degradaasje fan beide substraten.Om te ûndersiikjen oft de degradaasje fan Ssu72 en SNW1 regele wurdt troch proteasome-ubiquitinaasje, waard de proteasominhibitor MG132 tafoege om proteasomaktiviteit te ynhibearjen, en feitlik fûnen wy dat har degradaasjeproses ynhibearre waard (fig. 5f).Oanfoljende net-substraatdoelen waarden befêstige as Parkin-ynteraktoaren mei Western blotting (Supplementary Fig. 10), dy't konsekwinte resultaten mei LC-MS / MS sjen litte.Ta beslút, de yntegraasje fan 'e PDPL workflow mei doelprotein transfeksje ferifikaasje lit de identifikaasje fan net registrearre E3 ligase substrates.
Wy hawwe in mienskiplik platfoarm foar markearring ûntwikkele wêrmei jo yn romte en tiid ynteraksje POI's kinne identifisearje.It platfoarm is basearre op it miniSOG fotosensibilisatorprotein, dat mar sawat 12 kDa is, minder dan de helte fan 'e grutte fan it folwoeksen APEX2-enzyme (27 kDa) en ien tredde de grutte fan TurboID (35 kDa).De lytsere grutte soe it oanbod fan tapassingen foar it bestudearjen fan lytse proteïne-ynteraktomen sterk útwreidzje moatte.Fierdere ferkenning fan ekstra fotosensibilisatoren, itsij genetysk kodearre aaiwiten as lytse molekulen, is nedich om de kwantumopbringst fan singlet soerstof te fergrutsjen en de gefoelichheid fan dizze oanpak út te wreidzjen.Foar de hjoeddeistige ferzje fan miniSOG kin hege tydlike resolúsje wurde berikt mei blauwe ferljochting om proximity-markers te aktivearjen.Derneist hat langere eksposysjetiid in gruttere "wolk" fan singlet soerstof frijlitten, wat resulteart yn modifikaasje fan mear distale histidine-residuen, ferhege etiketteringsradius, en de mooglikheid om de romtlike resolúsje fan PDPL te fine.Wy hifke ek sân gemyske probes om de sinjaal-to-eftergrûnferhâlding te ferheegjen en ûndersocht it molekulêre meganisme efter dizze oanpak.De TOP-ABPP-workflow kombinearre mei ûnbidige iepen sykjen befêstige dat modifikaasjes allinich yn histidines foarkommen en gjin konsekwint mikroomjouwing waard waarnommen foar ferhege histidine-oanpassingen, útsein in matige foarkar foar histidines yn 'e loopregio.
PDPL is ek brûkt om subcellulêre proteomen te karakterisearjen mei proteomspesifisiteit en dekking op syn minst te fergelykjen mei oare proximity-labeling en organelle-spesifike gemyske probemetoaden.Proximity-markers binne ek mei súkses brûkt om it oerflak, lysosomale en sekretome-assosjearre proteomen te karakterisearjen46,47.Wy leauwe dat PDPL kompatibel sil wêze mei dizze subcellulêre organellen.Derneist hawwe wy PDPL útdage troch doelen te identifisearjen foar cytosolyske proteïnebinding dy't komplekser binne dan membraanbûne proteïnen fanwege har dynamyske eigenskippen en belutsenens by mear tydlike ynteraksjes.PDPL waard tapast op twa aaiwiten, de transkripsjonele coactivator BRD4 en de sykte-assosjearre ligase E3 Parkin.Dizze twa aaiwiten waarden net allinich keazen foar har fûnemintele biologyske funksjes, mar ek foar har klinyske relevânsje en therapeutyske potensjeel.Foar dizze twa POI's waarden bekende binende partners as net-registrearre doelen identifisearre.Opmerklik waard de faze-skieding-assosjearre proteïne SFPQ befêstige troch co-IP, wat in nije meganisme oanjaan kin wêrmei't BRD4 (koarte isoform) LLPS regulearret.Tagelyk leauwe wy dat de identifikaasje fan Parkin-substraten in senario is wêryn de identifikaasje fan yndirekte kleefstoffen fereaske is.Wy identifisearre twa unidentifisearre parkin-substraten en befêstige har degradaasje lâns it ubiquitinaasje-proteasoompaad.Koartlyn is in meganisme-basearre fangstrategy ûntwikkele om hydrolase-substraten te detektearjen troch se te fangen mei enzymen.Hoewol dit in heul krêftige metoade is, is it net geskikt foar de analyze fan substraten dy't belutsen binne by de foarming fan grutte kompleksen en fereasket de foarming fan kovalente bannen tusken it enzyme en it substraat.Wy ferwachtsje dat PDPL útwreide wurde kin om oare proteinkompleksen en enzymfamyljes te studearjen, lykas de deubiquitinase- en metalloproteasefamyljes.
In nije foarm fan miniSOG, neamd SOPP3, is ûntwikkele mei ferbettere singlet soerstofproduksje.Wy fergelike miniSOG mei SOPP3 en fûn ferbettere markearringsprestaasjes, hoewol it sinjaal-to-lûd-ferhâlding bleau ûnferoare (oanfoljende fig. 11).Wy hypoteze dat optimisaasje fan SOPP3 (bygelyks troch rjochte evolúsje) soe liede ta effisjinter fotosensibilisatorproteinen dy't koartere ljochttiden fereaskje en dus mear dynamyske sellulêre prosessen kinne wurde fêstlein.Opmerklik is de hjoeddeistige ferzje fan PDPL beheind ta de sellulêre omjouwing, om't it blauwe ljochtferljochting fereasket en djippe weefsels net kin penetrearje.Dizze funksje slút it gebrûk út yn diermodelstúdzjes.De kombinaasje fan optogenetika mei PDPL kin lykwols in kâns jaan foar bisteûndersyk, benammen yn it harsens.Derneist ferwiderje oare ynfraread fotosensibilisatoren ek dizze beheining.Op dit stuit wurdt op dit mêd ûndersyk dien.
De HEK293T-selline waard krigen fan ATCC (CRL-3216).De selline testte negatyf foar mycoplasma-ynfeksje en waard yn kultuer brocht yn DMEM (Thermo, #C11995500BT) oanfolle mei 10% fetale bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) en 1% penicilline/streptomycin (Hyclone, #SV30010).yngroeid.
3-Aminophenylene (sample 3) en (4-ethynylphenyl) methanamine (sample 4) waarden kocht fan Bidepharm.Propylamine (probe 2) waard kocht fan Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) waard synthesized neffens publisearre metoaden.
Oanfoljende tabel 1 listet de genetyske konstruksjes brûkt yn dizze stúdzje.De sekwinsjes fan miniSOG en KillerRed waarden klonearre fan in kadoplasmide fan P. Zou (Peking University).De mitochondriale matrix-targeting-sekwinsje waard ôflaat fan 'e 23 N-terminale aminosoeren fan COX4 en klonearre yn' e oanjûne fektors mei in Gibson-assemblage (Beyotime, #D7010S).Om it membraan en de kearn fan it endoplasmysk retikulum te rjochtsjen, SEC61B minsklik DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) fersterke troch PCR út in cDNA-bibleteek fan HEK293T-sellen, en H2B DNA (skonken troch D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) en cloned, lykas hjirboppe neamd.Behalven as oars oanjûn, waarden oare proteïngenen brûkt foar transfeksje en konstruksje fan stabile sellinen PCR fersterke út 'e HEK293T cell cDNA bibleteek.G3S (GGGS) en G4S (GGGGS) waarden brûkt as linkers tusken it baitprotein en miniSOG.In V5 epitoop tag (GKPIPNPLLGLDST) waard tafoege oan dizze fúzje konstruksjes.Foar ekspresje yn sûchdieren en om in stabile selline te fêstigjen, waard it miniSOG-fúzjekonstruksje subklonearre yn 'e pLX304 lentivirale fektor.Foar baktearjende ekspresje waard miniSOG klonearre yn 'e pET21a-fektor markearre 6xHis oan' e C-terminus.
HEK293T-sellen waarden sied op 2.0 x 105 sellen per put yn seis-well platen en transfected 24 oeren letter mei rekombinante lentivirale plasmiden (2.4 μg pLX304) en virale ferpakking plasmiden (1.5 μg psPAX2 en 1.2 μg psPAX2 en 1.2 μg mei Lip02. , #C0533), sawat 80% fúzje.Nei transfeksje fan 'e nacht waard it medium feroare en in oare 24 oeren ynkubeare.It sammeljen fan it firus waard útfierd nei 24, 48 en 72 oeren.Foarôfgeand oan ynfeksje fan 'e doelsellinen waard it virale medium troch in 0.8 μm filter (Merck, #millex-GP) filtere en polybrene (Solarbio, #H8761) waard tafoege oan in konsintraasje fan 8 μg / ml.Nei 24 oeren waarden de sellen tastien om te herstellen troch it medium te feroarjen.Sellen waarden selektearre mei 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) foar de earste trije passaazjes as in legere stringende seleksje.Dêrnei brûkte 20 μg / ml as in strangere regimen foar de folgjende trije passaazjes.
Sellen waarden sied yn 12-well keamers (Ibidi, #81201) by in tichtens fan likernôch 20.000 sellen per put.Om adhesion fan HEK293T-sellen te ferbetterjen, foegje 50 µg / ml fibronectin (Corning, #356008) ta, verdund yn fosfaatbufferde saline (PBS, Sangon, #B640435) by 37 ° C.De keamers waarden foarbehannele foar 1 oere en dan fuortsmiten mei PBS.Nei 24 oeren waarden sellen ien kear wosken mei PBS, ynkubeare mei 1 mM probe 3 yn frisse Hanks 'balansearre sâltoplossing (HBSS, Gibco, #14025092) foar 1 h op 37 ° C, en dan ynkubeare mei in blauwe LED (460 nm) ).) waarden bestraald foar 10 minuten by keamertemperatuer.Dêrnei waarden de sellen twa kear wosken mei PBS en fêstmakke mei 4% formaldehyde yn PBS (Sangon, #E672002) foar 15 minuten by keamertemperatuer.Oerstallige formaldehyd waard fuortsmiten út fêste sellen troch waskjen trije kear mei PBS.Sellen waarden doe permeabilized mei 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) yn PBS en wosken 3 kear mei PBS.Ferwiderje dan de keamer en foegje 25 µl fan in klikreaksjegemik ta oan elk monster dat 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) befettet. en 0,5 mg / ml natrium ascorbate (Aladdin, no. S105024) en incubated foar 30 minuten by keamertemperatuer.Nei in snapreaksje waarden sellen seis kear wosken mei PBS mei 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) en dêrnei blokkearre mei 5% BSA (Abcone, #B24726) yn PBST foar 30 minuten by keamertemperatuer.
Foar colocalization immunostaining, sellen waarden incubated mei primêre antylders neffens de oantsjutte betingsten: mûs anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), rabbit polyclonal anty-calnexin antybody (1:500, Abcam, #ab22595) of rabbit anti-lamin A/C monoclonal antybody (1:500; CST, #2032) at 4 °C nachts.Nei it waskjen fan 3 kear mei PBST waarden sellen ynkubeare mei sekundêre antykladen: geit anty-konyn Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) verdund 1:1000, geit anty-mûs Alexa Fluor 594 (CST, #8889) verdund 1:1000.verdunning Dilute by keamertemperatuer foar 30 minuten.Sellen waarden doe wosken 3 kear mei PBST en counterstained mei DAPI (Thermo, #D1306) yn PBS foar 10 minuten by keamertemperatuer.Nei 3 wassen mei PBS waarden sellen fersegele yn 50% glycerol (Sangon, #A600232) yn PBS foar ôfbylding.Immunofluorescent bylden waarden krigen mei in ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokale mikroskoop en ZNE 3.5 software.
Foar singlet soerstof fluorescent imaging, sellen waarden wosken twa kear mei Hanks HEPES buffer foardat it tafoegjen fan 100 nM Si-DMA yn Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05).Nei bleatstelling oan ljocht waarden de sellen yn in CO2-inkubator by 37 ° C foar 45 minuten ynkubeare.Sellen waarden doe twa kear wosken mei Hanks 'HEPES-buffer en tsjinkleure mei Hoechst yn Hanks' HEPES-buffer foar 10 minuten by keamertemperatuer en visualisearre mei in ZEISS LSM 900 konfokale mikroskoop., #M36008) yn HBSS-buffer mei kalsium en magnesium.Nei bleatstelling oan ljocht of doxorubicin (MCE, #HY-15142A), sellen waarden ynkubearre yn in CO2 incubator by 37 ° C. foar 10 minuten, wosken twa kear mei HBSS buffer, en incubated mei Hoechst yn HBSS buffer by keamertemperatuer.minuten.Doxorubicin waard brûkt as in positive probekontrôle wêrby't sellen behannele waarden mei 20 μM doxorubicin yn HBSS mei 1% BSA foar 30 min.Immunofluorescent bylden waarden krigen mei in Zeiss LSM 900 konfokale mikroskoop.
HEK293T-sellen dy't stabyl útdrukke mito-miniSOG waarden sied by in tichtens fan sawat 30% yn 15 sm skûtels.Nei 48 oeren, doe't ~ 80% gearrin waard berikt, waarden de sellen ien kear wosken mei PBS, ynkubeare mei 1 mM Probe 3 yn frisse HBSS-buffer yn foar 1 oere by 37 ° C en dan ferljochte mei in blauwe LED foar 10 minuten op keamer temperatuer..Dêrnei waarden de sellen twa kear wosken mei PBS, skrast en opnij suspendearre yn iiskâlde PBS-buffer mei EDTA-frije protease-ynhibitoren (MCE, #HY-K0011).Sellen waarden lysearre troch sonicating de tip foar 1 minút (1 sekonde oan en 1 sekonde út op 35% amplitude).It resultearjende mingsel waard foar 10 min by 4 ° C sintrifuge by 15,871 xg om pún te ferwiderjen, en de supernatant-konsintraasje waard oanpast oan 4 mg / ml mei in BCA-protein-assay-kit (Beyotime, #P0009).Kombinearje 1 ml fan it boppesteande lysate mei 0.1 mM fotodegradabel biotineazide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437), en 1 mM CuSO4-inkubator mei boaiem rotearje foar 1 oere by keamertemperatuer.Nei in snapreaksje, foegje it mingsel ta oan 'e pre-mingde oplossing (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) yn in 10 ml glêzen vial.De samples waarden mingd en sintrifuge by 4500 g foar 10 minuten by keamertemperatuer.De legere en boppeste oplossings waarden wegere, de precipitaat waard twa kear wosken mei 1 ml methanol en sintrifuge op 15871 × g foar 5 min by 4 ° C.Foegje 1 ml fan 8 M urea (Aladdin, nr. U111902) yn 25 mM ammoniumbikarbonat (ABC, Aladdin, nr. A110539) ta om it delslach op te lossen.Samples waarden rekonstituearre mei 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 yn 25 mM ABC) foar 40 minuten by 55 ° C folge troch de tafoeging fan 15 mM farsk iodoacetamide (Sangon, #A600539) by keamertemperatuer yn it tsjuster.Alkylaasje binnen 30 minuten..In ekstra 5 mM dithiothreitol waard tafoege om de reaksje te stopjen.Bereid likernôch 100 µl NeutrAvidin agarose kralen (Thermo, #29202) foar elke stekproef troch 3 kear te waskjen mei 1 ml PBS.De boppesteande proteom-oplossing waard verdund mei 5 ml PBS en ynkubeare mei pre-wosken NeutrAvidin agarose kralen foar 4 oeren by keamertemperatuer.De kralen waarden dan 3 kear wosken mei 5 ml PBS mei 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kear mei 5 ml PBS mei 1M urea, en 3 kear mei 5 ml ddH2O.De kralen waarden doe rispe troch sintrifugaasje en opnij suspendearre yn 200 μl fan 25 mM ABC mei 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) en 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinisearje oernacht by 37 ° C mei rotaasje.De reaksje waard stoppe troch it tafoegjen fan mieresûr (Thermo, # A117-50) oant de pH 2-3 berikte.De kralen waarden 3 kear wosken mei 1 ml PBS mei 0,2% SDS, 3 kear mei 1 ml PBS mei 1 M urea, en dan 3 kear mei 1 ml destillearre wetter.De modifisearre peptiden waarden frijlitten troch ljochtlysis (365 nm) foar 90 min mei 200 μl fan 70% MeOH.Nei centrifugaasje waard de supernatant sammele.De kralen waarden doe ien kear wosken mei 100 μl fan 70% MeOH en de supernatanten waarden gearfoege.Samples waarden droege yn in Speedvac vacuum concentrator en opslein by -20 ° C oant analyze.
Om singlet soerstof modifisearre peptiden te identifisearjen en te kwantifisearjen, waarden samples opnij oplost yn 0.1% mieresûr en 1 μg peptiden waarden analysearre mei in Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-massaspektrometer útrist mei in nano ESI-boarne fan Tune en Xcalibur fan ferkeapersoftware 4.3.Samples waarden skieden op in 75 µm × 15 sm ynterne ynpakt capillary kolom mei 3 µm C18 materiaal (ReproSil-pur, #r13.b9.) en ferbûn mei in EASY-nLC 1200 UHPLC systeem (Thermo).De peptiden waarden skieden troch lineêre 95 minuten gradientchromatografy fan 8% solvent B nei 50% solvent B (A = 0,1% mieresûr yn wetter, B = 0,1% mieresûr yn 80% acetonitril), dan lineêr ferhege nei 98% B min yn 6 min by in trochstreaming fan 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos sammelet gegevens ôfwikseljend tusken folsleine MS scan en MS2 scan ôfhinklik fan de gegevens.De sputterspanning waard ynsteld op 2,1 kV en de temperatuer fan 'e iontransportkapillar wie 320 °C.MS-spektra (350-2000 m / z) waarden sammele mei in resolúsje fan 120.000, AGC 4 × 105, en in maksimale ynfiertiid fan 150 ms.De 10 meast foarkommende mearfâldich opladen foarrinners yn elke folsleine scan waarden fragminteare mei HCD mei in normalisearre botsingsenerzjy fan 30%, in quadrupole-isolaasjefinster fan 1.6 m / z, en in resolúsje-ynstelling fan 30,000.In AGC-doel foar tandemmassaspektrometrie mei 5 × 104 en maksimale ynfiertiid 150 ms.De dynamyske útsûndering is ynsteld op 30 sekonden. Net tawiisde ioanen as dy mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS. Net tawiisde ioanen as dy mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Net tawiisde ionen as ionen mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ en >7+ были отклонены для МС/МС. Net spesifisearre ioanen of ioanen mei ladingen fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS.
De rauwe gegevens wurde ferwurke mei it FragPipe komputerplatfoarm basearre op MSFragger.Massafoaroardielen en oerienkommende aminosoeren waarden bepaald mei in iepen sykalgoritme mei in foarrinnermassatolerânsje fan -150 oant 500 Da.Modifisearre peptiden waarden doe identifisearre mei histidine-modifikaasjes mei massa-winsten fan +229.0964 en +247.1069 Da yn PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Sellen dy't it fusearre miniSOG-gen stabyl útdrukke, waarden platearre yn 6 sm skûtels.By it berikken fan ~ 80% gearrin, waarden sellen ien kear wosken mei HBSS (Gibco, #14025092), dan ynkubeare mei gemyske probes yn HBSS foar 1 oere by 37 ° C en ferljochte mei blau ljocht.10W LED foar 20 minuten by keamertemperatuer.Om te bepalen hokker type reaktive soerstofsoarten belutsen is by PDPL, 0,5 mM fitamine C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 waarden tafoege oan de sellen as oanfollingen.Nei it waskjen mei kâld PBS waarden sellen skrast, sammele yn 1.5 ml sintrifuge buizen, en sonicated mei in tip foar 1 min yn 200 μl fan PBS mei 1x protease-ynhibitor sûnder EDTA (1 s en 1 s sûnder, amplitude 35%).It resultearjende mingsel waard sintrifuge by 15,871 × g foar 10 min by 4 ° C en de supernatant-konsintraasje waard oanpast oan 1 mg / ml mei in BCA-protein-assay-kit.Likernôch 50 μl fan it boppesteande lysate waard ynkubearre mei 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, en 1 mM CuSO4 foar 1 oere by keamertemperatuer mei rotaasje fan ûnderen nei boppen.Nei de klikreaksje waard delslach mei aceton útfierd troch it tafoegjen fan 250 μl fan pre-gekoelde aceton oan 'e samples, ynkubearje by -20 ° C foar 20 min en sintrifuge by 6010 × g foar 10 min by 4 ° C.Sammelje de pellet en koekje yn 50 µl fan 1x Laemmli's buffer foar 10 min by 95 ° C.Samples waarden doe analysearre op SDS-PAGE lange gels en visualisearre mei it Bio-rad ChemiDoc MP Touch imaging systeem mei Image Lab Touch software.
Ekspresje en suvering fan it rekombinante miniSOG-6xHis-protein waard útfierd lykas earder beskreaun.Koartsein, E. coli BL21 (DE3) sellen (TransGen, #CD701-02) waarden transformearre mei pET21a-miniSOG-6xHis en protein ekspresje waard induced mei 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Nei sel lysis, aaiwiten waarden suvere mei help fan Ni-NTA agarose kralen (MCE, no. 70666), dialyzed tsjin PBS, en opslein by -80 ° C.
Foar in antybody-basearre in vitro label proximity assay, mix 100 μM suvere miniSOG, 1 mM probe 3, en 1 μg anty-label mûs monoklonaal antykodym (TransGen, #HT501-01) yn PBS ta in totale reaksje folume fan 50 μl..It reaksjegemik waard bestraald mei blau LED-ljocht foar 0, 2, 5, 10 en 20 minuten by keamertemperatuer.It mingsel waard ynkubeare mei 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA-ligand, en 1 mM CuSO4 foar 1 h by keamertemperatuer op in opwaartse bewegingshaker.Nei in snapreaksje, foegje 4x Laemmli's buffer direkt oan it mingsel ta en siede op 95 ° C foar 10 min.Samples waarden analysearre op SDS-PAGE gels en analysearre troch western blotting mei streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
In histidine-befette syntetyske peptide mei C-terminale amidaasje (LHDALDAK-CONH2) waard brûkt om tichtby peptide-basearre in vitro-labeling te analysearjen.Yn dizze assay waarden 100 μM suvere miniSOG, 10 mM probe 3 en 2 μg / ml syntetyske peptide mingd yn PBS yn in totale reaksjevolumint fan 50 μl.It reaksjegemik waard bestraald mei blau LED-ljocht foar 1 oere by keamertemperatuer.Ien mikroliter fan sample waard analysearre mei in LC-MS-systeem (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massaspektrometer mei MassLynx spektrum analyze software).
HEK293T-sellen dy't it miniSOG-fúzjegen stabyl ekspresje, waarden sied yn 10 sm skûtels foar rigels mei ferskate organelle lokalisaasje (Mito, ER, Nucleus) en 15 sm gerjochten foar Parkin-miniSOG en BRD4-miniSOG rigels.By it berikken fan ~ 90% gearrin, waarden de sellen ien kear wosken mei HBSS, dan ynkubeare mei probe 3 yn HBSS foar 1 oere by 37 ° C en ferljochte mei in 10 W blauwe LED by keamertemperatuer.Foar net-kontakt-labeling fan Parkin waard 10 µM protonkarbonylcyanide-drager m-chlorophenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) mei probe 3 yn HBSS foar 1 oere tafoege by 37 ° C.De sel lysis, klik skiekunde, reduksje en alkylation stappen wiene itselde as beskreaun hjirboppe, útsein dat 2 mg lysate waard tafoege en biotin PEG3 azide waard brûkt yn de klik reaksje ynstee fan photodegradable biotin azide.Nei ferriking waarden de kralen 3 kear wosken mei 5 ml PBS mei 0,2% SDS, 3 kear mei 5 ml PBS mei 1 M urea, en 3 kear mei 5 ml PBS.Dêrnei waard 2 µg trypsine tafoege oan 300 µl 25 mM ABC mei 1 M urea om it proteïne oernachtich by 37 ° C te spjalten.De reaksje waard stoppe troch it tafoegjen fan mieresûr oant in pH fan 2-3 waard berikt.Nei trypsinisaasje op kralen waard de peptide-oplossing ûntsalt mei in SOLAµ HRP-kolom (Thermo, #60209-001) en droech yn in Speedvac fakuümkonsintrator.Peptiden waarden opnij oplost yn 0.1% mieresûr en 500 ng fan peptiden waarden analysearre mei in Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspektrometer útrist mei de hjirboppe beskreaune nano-ESI boarne.Peptiden waarden skieden op kommersjele RP-HPLC precolumns (75 μm x 2 sm) (Thermo, nr. 164946) en analytyske RP-HPLC kolommen (75 μm x 25 sm) (Thermo, nr. 164941), beide fol mei 2 μm.gradient fan 8% nei 35% ACN yn 60 minuten, dan lineêr ferhege nei 98% B yn 6 minuten by in trochstreaming fan 300 Nl / min.MS-spektra (350-1500 m / z) waarden sammele mei in resolúsje fan 60.000, AGC 4 × 105, en in maksimale ynfiertiid fan 50 ms.Selektearre ioanen waarden sequentially fragminteare troch HCD yn 3 s syklusen mei in normalisearre botsing enerzjy fan 30%, in quadrupole isolaasje finster fan 1.6 m / z, en in resolúsje fan 15000. In 5 × 104 tandem massa spektrometer AGC doel en in maksimale ynjeksje tiid fan 22 ms waarden brûkt.De dynamyske útsluting is ynsteld op 45 sekonden. Net tawiisde ioanen as dy mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS. Net tawiisde ioanen as dy mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Net tawiisde ionen as ionen mei in lading fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ en >7+ были отклонены для МС/МС. Net spesifisearre ioanen of ioanen mei ladingen fan 1+ en>7+ waarden ôfwiisd foar MS / MS.
De stappen foar tarieding fan samples oant de ferriking fan 'e NeutrAvidin-kralen wiene itselde as yn' e LC-MS / MS-analyse hjirboppe beskreaun.Likernôch 50 μg lysate waard brûkt as ynfier foar laden kontrôle en 2 mg lysate waard brûkt foar klikreaksjes.Nei ferriking en waskjen mei neutravidin, waarden de bûne proteïnen eluearre troch it tafoegjen fan 50 μl fan Laemmli's buffer oan 'e agarose-harskorrels en siedend op 95 ° C. foar 5 minuten.Control load input en bead ferrike samples waarden analysearre troch SDS-PAGE en oerdroegen oan PVDF membranen (Millipore, #ISEQ00010) troch standert Western blot metoaden.De membranen waarden blokkearre mei 5% skiere molke (Sangon, #A600669) yn TBS dy't 0.1% tween-20 (TBST) befette en sequentieel ynkubeare mei primêre en sekundêre antykladen.Primêre antykladen waarden verdund 1: 1000 yn 5% skiere molke yn TBST en ynkubearre oernacht by 4 ° C.Sekundêre antykladen waarden brûkt yn in ferhâlding fan 1:5000 en ynkubeare foar 1 oere by keamertemperatuer.De membranen waarden visualisearre troch chemiluminescence mei it Chemidoc MP-ôfbyldingssysteem.Alle uncut scans fan blots en gels yn 'e figuer wurde presintearre as rauwe gegevens.
Primêre antykladen brûkt yn dizze stúdzje omfette konyn anty-SFPQ monoklonaal antykodym (CST, nr. 71992), rabbit anty-FUS monoklonaal antykodym (CST, nr. 67840), rabbit anty-NSUN2 polyklonaal antykodym (Proteintech, nr. 20854-1) AP), rabbit anti-mSin3A polyclonal antybody (Abcam, #ab3479), mûs anty-tag monoklonaal antykodym (TransGen, #HT201-02), mûs anty-β-actin monoklonaal antykodym (TransGen, #HC201-01), rabbit anty -CDK2 monoklonaal antykodym (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antybody tsjin CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antybody to DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antybody to PS5, #ABclonal- antibody to PS5, #ABclonal- DNAJB1 polyklonaal antykodym (ABclonal, # A5504).Dizze antykladen waarden brûkt by in 1:1000-dilution yn 5% skiere molke yn TBST.De sekundêre antykladen brûkt yn dizze stúdzje omfette anty-konijn IgG (TransGen, #HS101-01), anty-mûs IgG (TransGen, #HS201-01) by in 1:5000-dilution.
Om fierder te ûndersiikjen oft BRD4 ynteraksje mei SFPQ, stabile HEK293T en BRD4-miniSOG-sellen dy't HEK293T overexpressearje waarden plated yn 10 sm skûtels.Sellen waarden wosken mei kâld PBS en lysed yn 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) mei EDTA-frije protease inhibitor foar 30 minuten by 4 ° C.Dêrnei waarden de lysaten sammele yn 1.5 ml sintrifuge buizen en sintrifuge op 15,871 xg foar 10 min by 4 ° C.De supernatant waard rispe en ynkubeare mei 5 µg fan anty-V5 markearre mûs monoklonaal antykodym (CST, #80076) oernacht by 4 ° C.Waskje sawat 50 µl proteïne A/G magnetyske kralen (MCE, #HY-K0202) twa kear mei PBS mei 0,5% Tween-20.Dêrnei waarden de sellysaten ynkubeare mei magnetyske kralen foar 4 oeren by 4 ° C mei rotaasje fan ûnderen nei boppen.Dêrnei waarden de kralen fjouwer kear wosken mei 1 ml PBST-buffer en kocht op 95 ° C foar 5 min.Samples waarden analysearre op SDS-PAGE gels en oerdroegen oan PVDF membranen mei help fan standert Western blot metoaden.De membranen waarden blokkearre yn 5% skiere molke yn TBST en ynkubeare opfolgjend mei primêre en sekundêre antykladen.Primary Antibody Rabbit anty-SFPQ monoklonaal antykodym (CST, #71992) waard brûkt yn in ferhâlding fan 1:1000 yn 5% skiere molke yn TBST en ynkubeare oernacht by 4 ° C.Anti-konijn IgG waard brûkt yn in ferhâlding fan 1:5000 en ynkubeare foar 1 oere by keamertemperatuer.De membranen waarden visualisearre troch chemiluminescence mei it Chemidoc MP-ôfbyldingssysteem.
Alle struktueren dy't brûkt wurde foar de analyse fan 'e Solvent Accessible Surface Area (SASA) waarden krigen fan' e Protein Data Bank (PDB)52 of de AlphaFold Protein Structure Database53.Absolute SASA waard berekkene foar elk residu mei it FreeSASA-programma.Allinich folsleine en unambiguous SASA-gegevens foar markearre histidine en har buorlju waarden brûkt om de gemiddelde SASA foar elke struktuer te krijen.De relative solvent tagonklikens (RSA) foar elke histidine waard berekkene troch de absolute SASA-wearde te dielen troch it empiryske maksimale mooglike residu-oerflak beskikber foar it solvent.Alle histidines waarden dan klassifisearre as ferburgen as de gemiddelde RSA ûnder 20% wie, oars bleatsteld56.
Raw bestannen krigen yn DDA-modus waarden socht mei Proteome Discoverer (v2.5) of MSfragger (Fragpipe v15.0) yn 'e passende SwissProt-ferifieare proteindatabase mei mienskiplike kontaminanten.De peptiden easke folsleine trypsin mei twa ûntbrekkende spaltingsites, carbamoyl-methylaasje as in fêste modifikaasje en methionine-oksidaasje as in dynamyske modifikaasje.Foarrinner- en fragmintgewichttolerânsjes waarden ynsteld op respektivelik 10 ppm en 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Contaminant hits waarden fuortsmiten, en aaiwiten waarden filtere te krijen in falske ûntdekking taryf fan <1%. Contaminant hits waarden fuortsmiten, en aaiwiten waarden filtere te krijen in falske ûntdekking taryf fan <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициенте <1%. Contaminant hits waarden fuortsmiten en aaiwiten filtere te jaan in falske detection rate fan <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1% 的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы foar достижения уровня ложных <1%. Fersmoarge hits waarden fuortsmiten en aaiwiten filtere om in falsk posityf taryf fan <1% te berikken.Foar kwantitative analyze sûnder it brûken fan labels waard normalisearre proteïne-ynhâld fan trije biologyske werhellingen brûkt.Protein subcellulêre lokalisaasjeanalyse waard útfierd mei Gene Ontology (GO) analyse fan DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 en databases gearstald en publisearre troch de Alice Ting-groep.De fulkaankaart waard krigen fan Perseus (v1.6.15.0). Feroarings yn 'e oerfloed fan proteïne waarden hifke foar statistyske betsjutting mei in twa-sided t-test, en proteïne-hits waarden identifisearre mei oerfloedferoaring> 2 (útsein as oars oanjûn) en p-wearde <0.05. Feroarings yn 'e oerfloed fan proteïne waarden hifke foar statistyske betsjutting mei in twa-sided t-test, en proteïne-hits waarden identifisearre mei oerfloedferoaring> 2 (útsein as oars oanjûn) en p-wearde <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Feroarings fan proteïneynhâld waarden hifke foar statistyske betsjutting mei in twa-tailed t-test, en proteïne-wedstriden waarden identifisearre mei ynhâldferoaring> 2 (útsein as oars oanjûn) en ap-wearde <0.05.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 倍数 倍数 变化 倍数 显着性 变化 变化 变化 确定 命 统计 显着性 的 丰度 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 P 值 <0.05.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 数 数 数 数 数 变化 确定 的 命 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 P 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistyske betsjutting fan foldwizigingen yn proteïne-ynhâld waard hifke mei in twa-tailed t-test, en proteïne-oerienkomsten waarden bepaald foar ynhâldferoarings>2 (útsein as oars oanjûn) en p-wearden <0.05.Protein-ynteraksje-analyse waard útfierd mei GO-analyse tegearre mei de String-database.
Trije biologyske replikaten waarden útfierd mei ferlykbere resultaten.Statistyske analyze waard dien mei GraphPad Prism (GraphPad software) en fulkaan plots waarden oanmakke mei Perseus (v1.6.15.0).Om de twa groepen te fergelykjen, waarden p-wearden bepaald mei in twa-tailed Student's t-test.Allinich singletonproteinen identifisearre op syn minst twa kear yn 'e eksperimintele groep waarden opnommen yn' e fulkaanplots, en de oerienkommende ûntbrekkende wearden yn 'e kontrôtgroep waarden ferfongen troch Perseus út in normale ferdieling, sadat de p-wearde koe wurde berekkene.Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.Yn proteomyske analyzes foar statistyske analyze waard de oerfloed fan aaiwiten dy't ferskynden yn op syn minst twa biologyske replikaten behâlden.Statistyske metoaden waarden net brûkt om de stekproefgrutte foarôf te bepalen.De eksperiminten binne net samar.De ûndersikers wiene net blyn foar de taken by it eksperimint en de evaluaasje fan de resultaten.
Foar mear ynformaasje oer stúdzjeûntwerp, sjoch it Nature Research Report abstract keppele oan dit artikel.
De massaspektrometrygegevens krigen yn dizze stúdzje waarden yntsjinne oan it ProteomeXchange Consortium fia it iProX57 partnerrepository ûnder dataset ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.Dit artikel jout de orizjinele gegevens.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buert te kennen: gebrûk fan proximity-ôfhinklike biotinylaasje om proteinkompleksen te karakterisearjen en organellen yn kaart te bringen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buert te kennen: gebrûk fan proximity-ôfhinklike biotinylaasje om proteinkompleksen te karakterisearjen en organellen yn kaart te bringen.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Fertroud mei omjouwing: gebrûk fan proximity-ôfhinklike biotinylaasje om proteïnekompleksen en kaartorganellen te karakterisearjen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buert begripe: brûk de ôfhinklikens fan 'e buert fan biologysk libben.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Understanding proximity: karakterisaasje fan proteïnekompleksen en mapping fan organellen mei proximity-ôfhinklike biotinylaasje.Aktueel.Myn miening.Gemysk.biology 48, 44–54 (2019).
Gerry, JB et al.De mikroomjouwing yn kaart bringe troch Dexter-enerzjy oer te bringen nei ymmúnsellen.Wittenskip 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL, et al.Netwurken op twa proteomen skaal detektearje sel-spesifike ferbouwing fan it minsklik ynteraktoom.Sellen 184, 3022-3040.e3028 (2021).