Nijs

Tradysjonele diagnostyske strategyen foar it opspoaren fan ynfeksjesykten fereaskje it gebrûk fan benchtop-ynstruminten dy't net geskikt binne foar point-of-care-testen (POCT).Opkommende mikrofluidika is in heul miniaturisearre, automatisearre en yntegreare technology dy't in potinsjele alternatyf is foar tradisjonele metoaden foar rappe, lege kosten, krekte diagnostyk op it plak.Molekulêre diagnostyske metoaden wurde in protte brûkt yn mikrofluïdyske apparaten as de meast effektive metoaden foar deteksje fan patroanen.Dizze resinsje vat resinte foarútgong yn mikrofluid-basearre molekulêre diagnoaze fan ynfeksjesykten út sawol in akademysk as yndustrieel perspektyf.Earst beskriuwe wy in typyske on-chip-ferwurking fan nukleïnesoeren, ynklusyf sample-foarbehanneling, amplifikaasje en sinjaallêzing.De skaaimerken, foardielen en neidielen fan 'e fjouwer soarten mikrofluïdyske platfoarms wurde dan fergelike.Folgjende sille wy it gebrûk fan digitale assays besprekke foar de absolute kwantifikaasje fan nukleïnesoeren.Sawol klassike as resinte kommersjele mikrofluïdyske-basearre molekulêre diagnostyske apparaten wurde gearfette as bewiis fan 'e hjoeddeistige steat fan' e merk.Uteinlik stelle wy takomstige rjochtingen foar foar mikrofluïdyske diagnoaze fan ynfeksjesykten.
Ynfeksjesykten wurde feroarsake troch patogenen, ynklusyf baktearjes, firussen en parasiten, dy't oer de hiele wrâld ferspraat binne.Oars as oare sykten wurde patogenen gau ynfekteare en ferspriede tusken minsken en gastdieren troch ynokulaasje, loft en wettermedia [1].Previnsje fan ynfeksjesykten is kritysk as maatregel foar folkssûnens.Trije haadstrategyen foar it bestriden fan ynfeksjesykten: (1) kontrolearje de boarne fan ynfeksje;(2) ûnderbrekking fan it oerdrachtpaad;(3) beskerming fan gefoelige populaasjes.Under de wichtichste strategyen wurdt kontrôle fan 'e boarne fan ynfeksje beskôge as de wichtichste strategy fanwegen syn gemak en lege kosten.Snelle diagnoaze, isolemint en behanneling fan ynfekteare persoanen binne kritysk, dy't rappe, gefoelige en krekte diagnostyske strategyen nedich binne [2].De hjoeddeistige diagnoaze fan ynfeksjesykten kombinearret normaal klinysk ûndersyk basearre op tekens en symptomen en laboratoariumstúdzjes lykas selkultuer en molekulêre diagnoaze, dy't oplaat personiel, arbeidsintensive prosedueres en djoere testapparatuer nedich binne [3, 4].Previnsje fan útbraken fan ynfeksjesykten fereasket rappe, goedkeape en krekte lokale diagnoaze, foaral yn boarne-beheinde gebieten wêr't ynfeksjesykten gewoan en earnstich binne [5], lykas behanneling yn 'e woastenije as op it slachfjild, wêr't needgefallen ûnfoarspelber binne..medyske soarch is beheind [6].Yn dit ferbân is mikrofluidika in technology dy't mikro-elektromekanyske systeemtechnologyen, nanotechnology, as materiaalwittenskip kombineart foar krekte floeistofmanipulaasje [7,8,9,10], dy't nije mooglikheden foar punt-of-care-deteksje (POCT) leveret.) besmetlike aginten bûten sikehuzen en laboratoaria.Yn ferliking mei tradisjonele tiidslinend diagnoaze, biedt mikrofluïdyske technology sample- en kostenbesparring foar molekulêre diagnoaze by sykte-útbraken.De wrâldwide fersprieding fan coronavirus-sykte 2019 (COVID-19) wurdt feroarsake troch earnstich akute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), sadat it belang fan mikrofluidika foar de tydlike previnsje en kontrôle fan 'e pandemy wer beklamme wurdt [11, 12 , 13].Oars as tradisjonele diagnostyk brûkt mikrofluïdyske POCT lytse draachbere apparaten, fariearjend fan benchtop-analyzers oant lytse sidestream-teststrips om te testen tichtby it samplingpunt [14].Dizze tests hawwe simplistyske as gjin sample-tarieding, rappe sinjaalfersterking, en gefoelige sinjaallêzingen dy't resultearje yn koarte doer en krekte resultaten binnen minuten.De beskikberens en massaproduksje fan mikrofluïdyske ynstruminten foar sûnenssoarch hawwe har kosten-effektive en direkte diagnostyske tapassingen útwreide bûten it sikehûs, tichtby de pasjint, en sels thús.
Under de besteande strategyen foar diagnoaze fan ynfeksjesykten is molekulêre diagnoaze ien fan 'e meast gefoelige [15, 16].Derneist wurdt molekulêre diagnoaze faak brûkt as de gouden standert foar trochgeande detectie fan COVID-19, wêrtroch direkte deteksje fan firusspesifike regio's fan RNA as DNA mooglik makket foar it begjin fan in ymmúnreaksje [17, 18].Yn 'e hjoeddeistige resinsje presintearje wy de lêste foarútgong yn mikrofluidika-basearre molekulêre diagnostyske prosessen foar ynfeksjesykten, fan in akademysk perspektyf nei takomstige yndustriële perspektiven (Fig. 1).Wy sille begjinne mei trije wichtige stappen yn it opspoaren fan nukleïnesûr: foarbehanneling fan monsters op chip, amplifikaasje fan nukleïnesûr, en sinjaallêzen.Wy fergelike dan ferskate soarten mikrofluïdyske platfoarms mei har struktuer en funksje, mei unike skaaimerken (sterkten en swakkens).Digitale nukleïnesûrdeteksje wurdt fierder besprutsen en jûn as in foarbyld fan in tredde generaasje technology foar de absolute kwantifikaasje fan besmetlike pathogene molekulen.Derneist sille ferskate typyske en lêste kommersjele POCT-apparaten wurde presintearre om de hjoeddeistige steat fan 'e mikrofluïdyske POCT-merk foar molekulêre diagnostyk te demonstrearjen.Wy sille ek ús fisy foar takomstige applikaasjes beprate en útlizze.
Modules fan mikrofluïdyske chips foar deteksje fan nukleïnesoeren kinne wurde ferdield yn trije kategoryen (sampling, erkenning en sinjalearjen) neffens har funksjes [19].Under dizze modules realisearret de samplingmodule benammen sample lysis en nukleïnesûrekstraksje.De sensormodule kontrolearret benammen de konverzje en amplifikaasje fan nukleïnesûrsignalen.De sinjaalmodule detektearret it sinjaal dat wurdt omboud en ferwurke troch de sensormodule.Op grûn fan it proses fan it opspoaren fan nukleïnesoeren op in chip, sille wy de ferskate chips gearfetsje dy't de funksje "ynput en útfier" kinne realisearje.
De earste stap yn it opspoaren fan nukleïnesûr is nukleïnesûrekstraksje, dat wol sizze it isolearjen fan it doelnukleinsûr fan it orizjinele monster.Nukleïnesûr-ekstraksje wurdt útfierd om nukleïnesoeren fan oare molekulêre kontaminanten te suverjen, de yntegriteit fan 'e primêre struktuer fan nukleïnesûrmolekulen te garandearjen en resultaten te optimalisearjen.Nukleïnesoerwinning fereasket de nedige monsterlysis en nukleïnesûrfangst, wêrfan de kwaliteit en effisjinsje in enoarme ynfloed hawwe op ûndersyks- en diagnostyske resultaten.Elke subtile side-effekten by ekstraksje kinne fierdere deteksje beheine.Bygelyks, polymerase kettingreaksje (PCR) en loop isothermyske amplifikaasje (LAMP) metoaden wurde ynhibeare troch guon oerbleaune organyske solvents lykas ethanol en isopropanol yn nukleïnesoere isolaasje reagents [20].Liquid-floeistof-ekstraksje en fêste-fase-ekstraksje binne de populêrste metoaden foar it isolearjen fan nukleïnesoeren [21], lykwols, floeistof-floeistof-ekstraksje op in chip is ekstreem beheind, om't de reagentia dy't brûkt wurde yn floeistof-flüssige ekstraksje korrosje feroarsaakje fan de measte mikrofluïdyske chips .Hjir markearje wy mikroarray-basearre metoaden foar fêste faze-ekstraksje en fergelykje har foardielen en neidielen.
Silisium is in substraatmateriaal kompatibel mei nukleïnesoeren troch syn biokompatibiliteit, stabiliteit en maklike modifikaasje [22].Wichtich, doe't wizige mei silika as oare materialen, dit komposyt toant eigenskippen om negatyf laden nukleïnesoeren te adsorbearjen ûnder lege pH, hege sâltbetingsten, wylst elutie mei hege pH, oplossings mei leech sâlt.Op grûn fan dit ferskynsel is it mooglik om it nukleïnesûr te suverjen.
Ferskate foarmen fan silika-basearre materialen binne brûkt foar ekstraksje fan nukleïnesoeren yn mikrofluidika, lykas silika-kralen, poeders, mikrofiberfilters en silika-membranen [23, 24, 25, 26].Ofhinklik fan 'e eigenskippen fan it materiaal kinne silisium-basearre materialen op ferskate manieren brûkt wurde yn mikrocircuits.Bygelyks kinne silika-korrels, poeders en kommersjele nanofilters gewoan wurde pleatst yn 'e poaren of mikrokanalen fan mikrofluïdyske chips en helpe nukleïnesoeren út samples te ekstrahearjen [27, 28, 29].Surface-modifisearre silikamembranen kinne ek brûkt wurde om DNA rap te suverjen fan patogenen tsjin lege kosten.Bygelyks, Wang et al.[30] Troch kombinearjen fan denaturearjende amplifikaasjereaksjes mei vesicle-bemiddele ketenútwikseling mei silika-membranen bedekt mei chitosan-oligosaccharides, waard in alsidich draachber systeem yntrodusearre dat 102-108 koloanjefoarmjende ienheden mei súkses ûntdekte.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., en de oanwêzigens fan it firus wie maklik sichtber.Powell et al.[31] Silisium-basearre mikroarrays waarden doe brûkt om hepatitis C-firus (HCV), minsklik ymmúntekoartfirus (HIV), Zika-firus, en minsklik papillomafirus en automatyske propagaasje, wêryn in 1,3 μl kronkeljende mikroreaktor waard ûntwikkele om RNA-firussen te fangen.en útfiere in situ amplification.Neist dizze metoaden spylje oerflak-modifisearre silika-mikrokolommen ek in wichtige rol yn 'e nukleïnesûrwinning, om't de mjitkunde en eigenskippen fan it feroarjende materiaal de ekstraksje-effisjinsje sterk ferheegje.Chen et al.[32] foarstelde in mikrofluïdysk platfoarm foar isolaasje fan RNA mei lege konsintraasje basearre op amino-coated silisium mikrokolommen.Dit mikrofluïdyske apparaat yntegreart in array fan 0.25 cm2 mikropylders op in silisiumsubstraat om hegere ekstraksje-effisjinsje te berikken troch in ûntwerp mei hege oerflakte oant folumeferhâlding.It foardiel fan dit ûntwerp is dat it mikrofluïdyske apparaat maksimaal 95% nukleïnesûr-ekstraksje-effisjinsje kin berikke.Dizze silisium-basearre strategyen demonstrearje de wearde fan rap isolearjen fan nukleïnesoeren tsjin lege kosten.Yn kombinaasje mei mikrofluïdyske chips kinne silisium-basearre ekstraksjestrategyen net allinich de effisjinsje fan nukleïnesûrdeteksje ferheegje, mar ek de miniaturisaasje en yntegraasje fan analytyske apparaten fasilitearje [20].
Magnetyske skiedingsmetoaden brûke magnetyske dieltsjes om nukleïnesoeren te isolearjen yn 'e oanwêzigens fan in ekstern magnetysk fjild.Faak brûkte magnetyske dieltsjes omfetsje Fe3O4 of γ-Fe2O3 magnetyske dieltsjes bedekt mei silika, amino en karboksyl [33,34,35,36].It ûnderskiedende skaaimerk fan magnetyske dieltsjes yn ferliking mei silisium-basearre SPE-metoaden is it gemak fan manipulaasje en kontrôle mei eksterne magneten.
Mei help fan de elektrostatyske ynteraksje tusken nukleïnesoeren en silika, ûnder betingsten fan hege sâlt en lege pH, wurde nukleïnesoeren op it oerflak fan silika-coated magnetyske dieltsjes adsorbearre, wylst ûnder betingsten fan leech sâlt en hege pH de molekulen kinne wurde wosken wer..Silica-coated magnetyske kralen meitsje it mooglik om DNA út grutte folume samples (400 μL) te ekstraheren mei magnetysk kontroleare beweging [37].As demonstraasje, Rodriguez-Mateos et al.[38] brûkte ynstelbere magneten om de oerdracht fan magnetyske kralen nei ferskate keamers te kontrolearjen.Op grûn fan silika-coated magnetyske dieltsjes kinne 470 eksimplaren / ml fan SARS-CoV-2 genomysk RNA ekstrahearre wurde út ôffalwettermonsters foar LAMP reverse transcription detection (RT-LAMP) en it antwurd kin binnen 1 oere lêzen wurde.bleate each (fig. 2a).
Apparaten basearre op magnetyske en poreuze materialen.Konseptueel diagram fan it IFAST RT-LAMP mikrofluïdysk apparaat foar SARS-CoV-2 RNA-deteksje (oanpast fan [38]).b Centrifugale mikro apparaat foar dSPE fan buccale swab nucleic acid (oanpast fan [39]).c Ynboude self-powered sample concentrator mei help fan in FTA® card (oanpast fan [50]).d Fusion 5 filterpapier oanpast mei chitosan (oanpast fan [51]).SARS-CoV-2 swier akuut respiratory syndroom coronavirus 2, RT-LAMP reverse transcription loop bemiddelde isothermyske amplifikaasje, FTA finders technology partners, NA nucleic acid
Posityf opladen magnetyske dieltsjes binne ideaal foar it heakjen fan de fosfaatrêch fan in nukleïnesûr.By in bepaalde sâltkonsintraasje kinne de negatyf laden fosfaatgroepen fan nukleïnesoeren posityf opladen wurde op it oerflak fan 'e magnetyske gearstalde dieltsjes.Dêrom waarden magnetyske nanopartikels mei in rûch oerflak en in hege tichtens fan aminogroepen ûntwikkele foar de winning fan nukleïnesoeren.Nei magnetyske skieding en blokkearjen kinne magnetyske nanopartikels en DNA-kompleksen direkt brûkt wurde yn PCR, wat de needsaak foar komplekse en tiidslinende suverings- en elueringsoperaasjes elimineert [35].Magnetyske nanopartikels bedekt mei negative karboksylgroepen binne ek brûkt om nukleïnesoeren te skieden dy't op oerflakken binne adsorbearre yn hege konsintraasje fan polyetyleenglycol en natriumchloride-oplossingen [36].Mei dizze oerflak-modifisearre magnetyske kralen is DNA-ekstraksje kompatibel mei folgjende amplifikaasje.Dignan et al.[39] beskreau in automatisearre en draachbere sintrifugale mikrofluïdyske platfoarm foar foarbehanneling fan nukleïnesûr, wêrtroch net-technysk personiel it op side kin brûke.Derneist, de komptabiliteit fan de isolearre DNA mei LAMP, in metoade goed geskikt foar punt-of-care nucleic acid analyze, fierder toant minimale apparatuer easken en geskiktheid foar colorimetric assays (figuer 2b).
Magnetic bead metoaden biede de mooglikheid fan automatisearre ekstraksje, guon fan dy bestean yn kommersjele automatisearre nucleic acid extractors [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, Feriene Steaten), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Sina) en Biomek®;Beckman (Miami, Feriene Steaten).), Florida, Feriene Steaten)].De foardielen fan it kombinearjen fan magnetyske kralen mei mikrofluidika kinne brûkt wurde foar effisjinte automatisearre ekstraksje fan nukleïnesoeren, dy't mooglik de ûntwikkeling fan molekulêre diagnoaze kinne befoarderje;lykwols, de kombinaasje fan magnetyske kralen mei microfluidics noch fertrout swier op komplekse kontrôle systemen foar sekuere manipulaasje fan magnetyske kralen, dat ferklearret de populariteit fan kommersjele produkten wêzen bulk en djoer, dy't beheint de fierdere tapassing fan magnetyske kralen yn POCT.
Ferskate poreuze materialen lykas modifisearre nitrocellulosefilters, Finders Technology Associates (FTA) kaarten, polyethersulfone-basearre filterpapieren, en glycan-coated materialen binne ek brûkt foar deteksje fan nukleïnesoeren [40, 41, 42, 43, 44].Poreuze fibrous materialen lykas fibrous papier waarden earst brûkt om DNA te isolearjen troch fysyk langstrengige DNA-molekulen mei fezels te ferwikseljen.Lytse poaren liede ta in sterke fysike beheining fan DNA-molekulen, wat posityf beynfloedet op DNA-ekstraksje.Troch de ferskillende poargrutten fan fibrous papier kin de ekstraksje-effisjinsje net foldwaan oan 'e behoeften fan DNA-amplifikaasje [45, 46].De FTA-kaart is in kommersjeel filterpapier dat wurdt brûkt op it mêd fan forensyske medisinen en in soad brûkt yn oare gebieten fan molekulêre diagnostyk.Troch it gebrûk fan cellulosefilterpapier impregnearre mei ferskate gemikaliën om de selmembranen yn 'e stekproef te lysearjen, wurdt it frijjûn DNA oant 2 jier beskerme tsjin degradaasje.Mear resint is impregnearre cellulosepapier ûntwikkele foar molekulêre deteksje fan ferskate patogenen, ynklusyf SARS-CoV-2, leishmaniasis, en malaria [47,48,49].HIV yn de isolearre plasma wurdt lysed direkt, en de virale nucleic acid wurdt ferrike yn de FTA® flow membraan boud yn de concentrator, dy't mooglik makket effisjinte produksje fan de nucleic acid [50] (Fig. 2c).It wichtichste probleem mei deteksje fan nukleïnesoeren mei FTA-kaarten is dat gemikaliën lykas guanidine en isopropanol de folgjende amplifikaasjereaksjes ynhibeare.Om dit probleem op te lossen, hawwe wy Fusion 5 chitosan-modifisearre filterpapier ûntwikkele, dat de foardielen kombineart fan sawol de fysike interlacing fan DNA-molekulen en fibrous filterpapier, en de elektrostatyske adsorpsje fan DNA op chitosan-modifisearre ferbiningen om heul effisjinte nukleïnesûr-ekstraksje te berikken. ..filterfezels [51] (fig. 2d).Likegoed, Zhu et al.[52] demonstrearre in chitosan-modifisearre PCR-metoade basearre op in in situ kapillêr mikrofluïdysk systeem foar rappe isolaasje en deteksje fan Zika-firus RNA.Nucleic soeren kinne wurde adsorbearre / desorbed yn in mingd lysate / PCR medium, respektivelik, basearre op de oan / út switch eigendom fan chitosan.oan en út", reageare op pH.
Lykas hjirboppe neamd, kombinearje dizze strategyen de foardielen fan ferskate fêste faze materialen en ferheegje de effisjinsje fan nukleïnesûrekstraksje yn mikrofluidika.Yn praktyske tapassingen, it brûken fan dizze materialen yn grutte hoemannichten is uneconomical, en goede oerflak behanneling of oerflak modifikaasje fan mienskiplike materialen mei dizze materialen kin ek behâlde harren funksje.Dêrom wurdt leaud dat de ymplemintaasje fan dizze strategyen nei in pilotstúdzje de kosten kin ferminderje.
Nukleïnesoerentesten op mikrofluïdyske platfoarms brûke faak lytse samplevoluminten (< 100 µl), dêrom fereasket amplifikaasje fan 'e doelnukleinsoeren mei spesifike probes foar konverzje nei in sinjaal dat handich is foar streamôfwerts deteksje (optysk, elektrysk en magnetysk) [53, 54]. Nukleïnesoerentesten op mikrofluïdyske platfoarms brûke faak lytse samplevoluminten (< 100 µl), dêrom fereasket amplifikaasje fan 'e doelnukleinsoeren mei spesifike probes foar konverzje nei in sinjaal dat handich is foar streamôfwerts deteksje (optysk, elektrysk en magnetysk) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. By it testen fan nukleïnesoeren op mikrofluïdyske platfoarms wurde faak lytse samplevoluminten (<100 µL) brûkt, sadat de amplifikaasje fan doelnukleïnesoeren mei spesjale probes nedich is om it te konvertearjen yn in sinjaal dat handich is foar folgjende deteksje (optysk, elektrysk en magnetysk) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 检测 通常 通常 使用 小样本量 (<100 μ 特定 探针 扩增 目标 核酸 便于 下游 检测 检测 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学 为 为 为 为 为 电学. ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 检测 检测 检测 检测 ((<100 μ 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 (光学, 电学 磁学) 的 信号 [53, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Deteksje fan nukleïnesoeren op mikrofluïdyske platfoarms brûkt gewoanlik lytse samplevoluminten (<100 μl), dy't fersterking fan doelnukleinsoeren fereasket mei spesjale probes om se te konvertearjen yn sinjalen foar folgjende deteksje (optysk, elektrysk en magnetysk) [53, 54]] .Nukleïnesûrfersterking yn mikrofluidika kin ek reaksjes fersnelle, deteksjegrinzen optimalisearje, sample-easken ferminderje, en deteksjenaaktens ferbetterje [55, 56].Yn 'e ôfrûne jierren, mei it realisearjen fan rappe en krekte deteksje, binne ferskate metoaden foar nukleïnsûr-amplifikaasje tapast yn mikrofluidika, ynklusyf PCR en guon isothermyske amplifikaasjereaksjes.Dizze seksje sil metoaden gearfetsje foar deteksje fan nukleïnesûr basearre op mikrofluïdyske systemen.
PCR is in simulaasje fan it DNA-replikaasjeproses fan in organisme, wêrfan de teory earne oars yn detail beskreaun wurdt en hjir net besprutsen wurdt.PCR kin in heul lyts bedrach fan doel-DNA / RNA op in eksponinsjele taryf fersterkje, wêrtroch PCR in krêftich ark is foar de rappe detectie fan nukleïnesoeren.Yn 'e ôfrûne desennia binne in protte draachbere mikrofluïdyske apparaten útrist mei PCR-thermyske fytssystemen ûntwikkele om te foldwaan oan' e behoeften fan punt-fan-soarch diagnostyk [57, 58].On-chip PCR kin wurde ferdield yn fjouwer soarten (konvinsjonele, trochgeande stream, romtlik skeakele, en konvektive PCR) neffens ferskate metoaden foar temperatuerkontrôle [59].Bygelyks, Gee et al.[60] ûntwikkele in direkte reverse transkripsje kwantitative PCR (RT-qPCR) metoade op har eigen mikrofluïdysk platfoarm foar de multiplex detectie fan SARS-CoV-2, gryp A en B firussen yn keel swab samples (Fig. 3a).Park et al.[61] boude in ienfâldige patogenanalyse-chip troch yntegrearjen fan tinne film PCR, elektroden, en in finger-oandreaune polydimethylsiloxane-basearre mikrofluïdyske module.Beide wurken befetsje lykwols de mienskiplike tekoartkommingen fan konvinsjonele PCR.PCR fereasket termyske fytsen, wat fierdere apparaatminiaturisaasje en fermindere testtiid beheint.
De ûntwikkeling fan trochgeande stream basearre mikrofluïdyske en romte-skeakele PCR is kritysk om dit probleem oan te pakken.Mei help fan in lange serpentine kanaal of in koarte rjochte kanaal, trochgeande flow PCR kin foarsjen flugge amplification troch aktyf circulating reagents yn trije preheat sônes mei in off-chip pomp.Dizze operaasje foarkomt mei súkses de oergongsfaze tusken ferskillende reaksjetemperatueren en ferminderet sadwaande de testtiid signifikant [62] (Fig. 3b).Yn in oare stúdzje fan Jung et al.[63] foarstelde in nije rotary PCR genetyske analysator dy't kombinearret de skaaimerken fan fêste en flow PCR foar ultrasnelle en multiplex reverse transkripsje PCR (Fig. 3c).Foar nucleic acid amplification, de PCR microchip wurdt rotearre troch trije ferwaarming blokken op ferskillende temperatueren: 1. Denaturation blok 94 ° C, 2. Annealing blok op 58 ° C, 3. Utwreiding blok op 72 ° C.
Applikaasje fan PCR yn mikrofluidika.Skematyske foarstelling fan dirRT-qPCR op in mikrofluidysk platfoarm (oanpast fan [60]).b Skematyske foarstelling fan in trochgeande stream PCR mikroarray basearre op in serpentine kanaal (oanpast fan [62]).c Skematyske foarstelling fan in rotearjende PCR genetyske analysator, besteande út in mikrochip, trije ferwaarming blokken en in stepper motor (oanpast fan [63]).d Diagram fan thermoconvection PCR mei centrifugation en opset (oanpast fan [64]).DirRT-qPCR, direkte kwantitative omkearde transkripsje-polymerase-kettingreaksje
Mei help fan kapillaren en loops of sels tinne platen, konveksje PCR kin fluch fersterkje nucleic soeren troch natuerlike frije termyske konveksje sûnder de needsaak foar in eksterne pomp.Bygelyks, in cyclic olefin polymer microfluidic platfoarm waard ûntwikkele op in fabrisearre rotearjende ferwaarming poadium dat brûkt termyske fytsen mei centrifugation yn in PCR loop microchannel [64] (Fig. 3d).De reaksje oplossing wurdt dreaun troch termyske konveksje, dy't kontinu wikselt hege en lege temperatuer yn in mikrokanaal mei in ringfoarmige struktuer.It hiele amplifikaasjeproses kin yn 10 minuten foltôge wurde mei in deteksjelimyt fan 70,5 pg / kanaal.
Lykas ferwachte is rappe PCR in krêftich ark foar folslein yntegreare sample-antwurd molekulêre diagnostyske en multipleksanalysesystemen.Rapid PCR fermindert de tiid dy't nedich is om SARS-CoV-2 te detektearjen signifikant, wat bydraacht oan de effektive kontrôle fan 'e COVID-19-pandemy.
PCR fereasket in komplekse termyske cycler dy't net geskikt is foar POCT.Mear resint binne isothermyske amplifikaasjetechniken tapast op mikrofluidika, ynklusyf, mar net beheind ta LAMP, rekombinase-polymerase-amplifikaasje (RPA), en amplifikaasje basearre op nukleïnesoere-sekwinsjes [65,66,67,68].Mei dizze techniken wurde nukleïnesoeren fersterke by in konstante temperatuer, en fasilitearje de skepping fan lege kosten, heul gefoelige draachbere POCT-apparaten foar molekulêre diagnostyk.
High-throughput mikrofluidika-basearre LAMP-assays tastean meardere deteksje fan ynfeksjesykten [42, 69, 70, 71].Yn kombinaasje mei in sintrifugale mikrofluïdyske systeem kin LAMP de automatisearring fan nukleïnsûrdeteksje [69, 72, 73, 74, 75] fierder fasilitearje.De spin-en-reagearje SlipChip waard ûntwikkele foar de fisuele deteksje fan meardere parallelle baktearjes mei LAMP [76] (Fig. 4a).By it brûken fan optimalisearre LAMP yn 'e assay, wie de fluorescinsje-sinjaal-oan-lûd-ferhâlding sawat 5-fâld, en de deteksjelimyt berikte 7.2 kopyen / μl fan genomysk DNA. Boppedat, it bestean fan fiif mienskiplike digestive baktearjele pathogenen, ynklusyf Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, waarden fisualisearre basearre op de metoade yn <60 min. Boppedat, it bestean fan fiif mienskiplike digestive baktearjele pathogenen, ynklusyf Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, waarden fisualisearre basearre op de metoade yn <60 min.Boppedat waard de oanwêzigens fan fiif mienskiplike baktearjele patogenen fan 'e spijsvertering traktaat, ynklusyf Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, visualisearre mei dizze metoade yn minder dan 60 minuten.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 视化 五 种 的 存在 消化道 细菌病 原体 的 存在 消化道 包括 芽孢杆菌 芽孢杆菌 沙门 沙门 肠 肠 肠 肠 肠 沙门 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 了 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 常见 消化道 包括 大 存在 大 包括 包括 大 大, 肠 氏 菌, 弧菌 和 副溶血 性 ... 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPDerneist waard de oanwêzigens fan fiif mienskiplike bakteriële gastrointestinale patogenen, ynklusyf Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius, en Vibrio parahaemolyticus, visualisearre mei dizze metoade yn minder dan 60 minuten.
De foardielen fan LAMP yn mikrofluidika omfetsje ûnder oaren rappe reaksje en miniaturisearre deteksje.Troch de reaksjetemperatuer (sawat 70 ° C) wurde lykwols ûnûntkomber aerosolen generearre tidens LAMP, wat resulteart yn in hege falske positive taryf.Assay-spesifisiteit, primerûntwerp en temperatuerkontrôle moatte ek wurde optimalisearre foar LAMP.Derneist binne chipûntwerpen dy't meardere doeldeteksje ymplementearje op ien chip fan grutte wearde en moatte wurde ûntwikkele.Dêrneist LAMP is geskikt foar multi-purpose detection yntegrearre yn ien chip, dat is fan grut belang, mar der is noch in soad romte foar ûntwikkeling.
De hege falske positive taryf fan LAMP kin foar in part fermindere wurde mei RPA, om't de relatyf lege reaksjetemperatuer (~ 37 ° C) resulteart yn relatyf in pear ferdampingsproblemen [77].Yn it RPA-systeem begjinne twa tsjinoerstelde primers DNA-synteze troch te binen oan in rekombinase en amplifikaasje kin binnen 10 minuten foltôge wurde [78,79,80,81].Dêrom is it hiele RPA-proses folle rapper dan PCR of LAMP.Yn 'e ôfrûne jierren is mikrofluïdyske technology oantoand om de snelheid en krektens fan RPA [82,83,84] fierder te ferbetterjen.Bygelyks, Liu et al.[85] ûntwikkele in mikrofluïdyske yntegreare laterale flow-polymerase-rekombinase-amplifikaasje-assay foar rappe en gefoelige deteksje fan SARS-CoV-2 troch yntegrearjen fan omkearde transkripsje RPA (RT-RPA) en in universele laterale flow-teststrip-deteksjesysteem.yn ien mikrofluïdysk systeem.figuer 4b).De deteksjelimyt is 1 kopy / µl as 30 kopyen / sample, en deteksje kin yn sawat 30 minuten foltôge wurde.Kong et al.hawwe ûntwikkele in wearable microfluidic apparaat.[86] brûkte lichemstemperatuer en in mobile telefoan-basearre fluorescence-deteksjesysteem om HIV-1 DNA rap en direkt te detektearjen mei RPA (figuer 4c).De draachbere RPA-assay detektearret 100 eksimplaren / ml fan 'e doelsekwinsje binnen 24 minuten, en toant in grut potensjeel foar rappe diagnoaze fan HIV-1-ynfekteare pjutten yn boarne-beheinde ynstellings.
Isothermyske amplifikaasje yn point-of-care testen (POCT).Untwikkeling en produksje fan spin en reaksje SlipChip.Nei plasma welding, de boppeste en ûnderste chips waarden gearstald mei in set fan nuten foar in foarmje de finale chip (oanpast fan [76]).b Skematyk fan it MI-IF-RPA-systeem foar detectie fan COVID-19 (oanpast fan [85]).c Skematyk fan in draachbere RPA-test foar rappe deteksje fan HIV-1 DNA (oanpast fan [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, human immunodeficiency virus HIV, RPA recombinase polymerase amplification, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Integrated Microbinase Polymerase Amplification
Microfluidic-basearre RPA ûntwikkelet rap, lykwols, de kosten fan chipfabrikaasje en reaksjeferbrûk binne te heech en moatte wurde fermindere om de beskikberens fan dizze technology te fergrutsjen.Derneist kin de hege gefoelichheid fan RPA de amplifikaasje fan net-spesifike produkten beynfloedzje, benammen yn 'e oanwêzigens fan kontaminaasje.Dizze beheiningen kinne ynfloed hawwe op de tapassing fan RPA yn mikrofluïdyske systemen en fertsjinje fierdere optimalisaasje.Goed ûntworpen primers en probes foar ferskate doelen binne ek nedich om de helberens fan RPA-basearre mikrofluïdyske strategyen yn POCT te ferbetterjen.
Cas13 en Cas12a hawwe de mooglikheid om willekeurich cleave nucleic soeren en sa kinne wurde ûntwikkele as deteksje en diagnostyske ark.Cas13 en Cas12a wurde aktivearre by bining oan doel DNA of RNA, respektivelik.Ienris aktivearre, begjint it proteïne oare tichtby lizzende nukleïnesoeren te spjalten, wêrnei't gids-RNA's dy't rjochte binne op pathogen-spesifike nukleïnesoeren, dwêste fluorescent probes kinne spjalte en fluoreszinsje frijlitte.Op grûn fan dizze teory, Kellner et al.[87] ûntwikkele in Cas13-basearre metoade [Spesifike High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], en Broughton et al.[88] ûntwikkele in oare oanpak basearre op Cas12a [CRISPR Trans Reporter rjochte op DNA-endonuklease (DTECR)].
Yn 'e ôfrûne jierren binne ferskate metoaden ferskynd foar it opspoaren fan nukleïnesoeren basearre op CRISPR [89, 90].Konvinsjonele CRISPR-basearre metoaden binne faak tiidslinend en arbeidsintensyf fanwegen meardere prosedueres, ynklusyf nukleïnsûrekstraksje, amplifikaasje en CRISPR-deteksje.Bleatstelling fan floeistoffen oan loft kin de kâns fergrutsje fan falske positive resultaten.Sjoen it boppesteande binne CRISPR-basearre systemen yn drege ferlet fan optimalisaasje.
In pneumatysk kontroleare mikrofluïdysk platfoarm dat 24-analyzes parallel kin útfiere is ûntwikkele foar CRISPR-Cas12a en CRISPR-Cas13a-deteksjeapplikaasjes [91].It systeem is foarsjoen fan in apparaat foar fluorescence-deteksje dy't nukleïnesûr-amplifikaasje omgiet en automatysk femtomolêre DNA- en RNA-monsters detektearret.Chen et al.[92] yntegreare rekombinase-amplifikaasje mei it CRISPR-Cas12a-systeem yn sintrifugale mikrofluidika (fig. 5a).Dit wurk oerwint de muoite fan it yntegrearjen fan dizze twa prosessen, om't Cas12a messenger-DNA kin fertarje en it amplifikaasjeproses ynhiberje.Derneist, Chen et al.[92] boppedat pre-opslein de reaksje reagents yn in centrifugal microfluidic kontrôle te foltôgjen it hiele proses automatysk.Yn in oar wurk, Silva et al.[93] ûntwikkele in diagnostyske metoade sûnder CRISPR/Cas12a-amplifikaasje en in smartphone om SARS-CoV-2 te detektearjen (fig. 5b).Dizze assay, bekend as in cellphone-basearre amplifikaasjefrij systeem, omfettet in CRISPR / Cas-ôfhinklik enzyme dat is basearre op smartphone-fisualisaasje fan katalase-genereare bubble-sinjalen yn mikrofluïdyske kanalen.Sensitive deteksje fan minder dan 50 kopyen / µl nukleïnesûr sûnder pre-amplifikaasje, it heule proses fan sample-ynjeksje oant sinjaallêzing nimt mar 71 minuten.
Nucleic acid detection metoaden basearre op CRISPR.Sintrifugale POCT foar yntegreare molekulêre diagnostyk basearre op CRISPR (oanpast fan [92]).b Untwikkeling fan 'e CASCADE-test foar smartphone-basearre analyze fan SARS-CoV-2 (oanpast fan [93]).RAA recombinase amplification, PAM neistlizzende protospacer motyf, CRISPR klustere koarte palindromic werhellingen op reguliere yntervallen, CASCADE systeem sûnder mobile telefoan amplification mei CRISPR / CAS-ôfhinklike enzymen, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride EDC
As de lêste stap yn it opspoaren fan nukleïnesûr, wjerspegelet sinjaaldeteksje direkt diagnostyske resultaten en is in krityske faktor yn 'e ûntwikkeling fan in effisjinte, gefoelige en krekte POCT.Sinjalen kinne wurde lêzen mei ferskate metoaden lykas fluorescent, elektrogemyske, kolorimetryske en magnetyske strategyen.Yn dizze paragraaf beskriuwe wy de reden foar elke oanpak en fergelykje de molekulêre diagnoaze fan ynfeksjesykten yn mikrofluidika.
Fluorescence-basearre strategyen wurde breed brûkt foar POCT-diagnostik fan ynfeksjesykten fanwege har opmerklike foardielen fan poerbêste gefoelichheid, lege kosten, maklike operaasje, en punt-fan-soarchanalyse [94, 95].Dizze strategyen brûke markearre fluorofoaren lykas fluorescent kleurstoffen en nanomaterialen om in detectable sinjaal te meitsjen (fluorescence-ferbettering of quenching).Dizze fynst suggerearret dat fluorescinsje-basearre strategyen kinne wurde ferdield yn direkte fluorescent labeling, sinjaal-on, en sinjaal-off fluorescent detection [96].Direkte fluorescent label-deteksje brûkt spesjale fluorescent labels om spesifike liganden te markearjen dy't in spesifike hoemannichte fluorescinsje generearje as se selektyf bûn oan in doel.Foar sinjaal-basearre fluorescence-deteksje is de kwaliteit fan it fluorescent sinjaal posityf besibbe oan de grutte fan belang.Fluorescence-yntensiteit is negligible yn it ûntbrekken fan in doel en is detectable as in foldwaande hoemannichte doel is oanwêzich.Oarsom is de yntinsiteit fan fluoreszinsje ûntdutsen troch "sinjaal-off" fluoreszinsje omkeard evenredich mei it bedrach fan doel, yn earste ynstânsje in maksimale wearde te berikken en stadichoan ôfnimme as it doel wurdt fergrutte.Bygelyks, it brûken fan it CRISPR-Cas13a doel-ôfhinklike trans-cleavage-meganisme, Tian et al.[97] ûntwikkele in nije erkenningstrategy om RNA's te detektearjen dy't omkearde transkripsje direkt omgeane (Fig. 6a).By bining oan komplemintêre doel-RNA's kin it CRISPR-Cas13-RNA-kompleks aktivearre wurde, wat transcollaterale splitsing oansette troch net-spesifike reporter-RNA's.De fluorescent markearre reporter [fluorofoor (F)] wurdt quenched troch de quencher (Q) yntakt en fluoresceart as se troch it aktivearre kompleks spjalt.
It foardiel fan elektrogemyske deteksje is hege deteksjesnelheid, maklike produksje, lege kosten, maklik te dragen en automatyske kontrôle.It is in krêftige analytyske metoade foar POCT-applikaasjes.Op grûn fan grafene fjild-effekt transistors Gao et al.[98] ûntwikkele in nanobiosensor foar de multiplex detectie fan Lyme sykte antigens út Borrelia burgdorferi baktearjes mei in deteksje limyt fan 2 pg / mL (Fig. 6b).
Kolorimetryske assays binne brûkt yn POCT-applikaasjes, profitearje fan de foardielen fan portabiliteit, lege kosten, maklike tarieding, en fisueel lêzen.Kolorimetryske deteksje kin de oksidaasje fan peroxidase of peroxidase-like nanomaterialen, de aggregaasje fan nanomaterialen, en de tafoeging fan yndikatorkleuren brûke om ynformaasje te konvertearjen oer de oanwêzigens fan doelnukleinsoeren yn sichtbere kleurferoaringen [99, 100, 101].Opmerklik wurde gouden nanopartikels breed brûkt yn 'e ûntwikkeling fan kolorimetryske strategyen, en troch har fermogen om rappe en signifikante kleurferoaringen te inducearjen, is d'r tanimmende belangstelling foar de ûntwikkeling fan POCT kolorimetryske platfoarms foar in situ diagnoaze fan ynfeksjesykten [102].Mei in yntegreare sintrifugale mikrofluïdyske apparaat [103] kinne fiedingsferoaringen yn fersmoarge molkemonsters automatysk wurde ûntdutsen op it nivo fan 10 baktearjele sellen, en de resultaten kinne binnen 65 minuten visueel lêzen wurde (figuer 6c).
Magnetyske sensingtechniken kinne analyten sekuer detektearje mei magnetyske materialen, en d'r hat de lêste desennia signifikante belangstelling west foar POCT-applikaasjes.Magnetyske sensingtechniken hawwe wat unike foardielen, lykas lege kosten magnetyske materialen ynstee fan djoere optyske komponinten.It gebrûk fan in magnetysk fjild ferbettert lykwols deteksje-effisjinsje en ferminderet de tiid foar tarieding fan samples [104].Dêrnjonken demonstrearje de resultaten fan magnetyske probearjen hege spesifisiteit, gefoelichheid en hege sinjaal-oan-lûd-ferhâlding troch it ûnbedoelde magnetyske eftergrûnsinjaal fan biologyske samples [105].Sharma et al.yntegrearre in magnetyske tunnelknooppunt basearre biosensor yn in draachbere mikrochipplatfoarm.[106] foar multiplex opspoaren fan sykteferwekkers (figuer 6d).Biosensors detektearje gefoelich subnanomolêre nukleïnesoeren isolearre fan patogenen.
Typyske metoade foar sinjaaldeteksje.It konsept fan hyperlokalisearre deteksje fan Cas13a (oanpast fan [97]).b Graphene nanobiosensor FET yn kombinaasje mei Lyme GroES scFv (oanpast fan [98]).c Kolorimetryske oanwizings foar multiplex detectie fan fiedingsferoare sykteferwekkers yn in sintrifugale mikrofluïdyske chip: No. .d Biosensor basearre op in magnetyske tunnel junction, ynklusyf in platfoarm, in ynboude blokkearjende fersterker, in kontrôle ienheid, en in macht oanbod foar sinjaal generaasje / akwisysje (oanpast fan [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
Nettsjinsteande de treflike skaaimerken fan de boppesteande opspoaren metoaden, se hawwe noch altyd neidielen.Dizze metoaden wurde fergelike (tabel 1), ynklusyf guon applikaasjes mei details (foar- en neidielen).
Mei de ûntwikkeling fan mikrofluidika, mikroelektromeganyske systemen, nanotechnology en materiaalwittenskip, wurdt it gebrûk fan mikrofluidyske chips foar it opspoaren fan ynfeksjesykten konstant foarútgong [55,96,107,108].Sekuere manipulaasje fan miniatuerapparatuer en floeistoffen draacht by oan diagnostyske krektens en kosten-effektiviteit.Dêrom, foar fierdere ûntwikkeling, binne ynspanningen dien om de chips te optimalisearjen en te ferbetterjen, wat resulteart yn ferskate mikrofluïdyske chips mei ferskate struktueren en funksjes.Hjir yntrodusearje wy koart ferskate mienskiplike soarten mikrofluïdyske platfoarms en fergelykje har skaaimerken (foar- en neidielen).Derneist rjochtsje de measte fan 'e hjirûnder neamde foarbylden primêr op it bestriden fan SARS-CoV-2.
LOCC's binne de meast foarkommende miniaturisearre komplekse analytyske systemen en har operaasjes binne tige miniaturisearre, yntegreare, automatisearre en parallelisearre fan sample-ynjeksje en tarieding, streamkontrôle en floeistofdeteksje [109, 110].Fluids wurde manipulearre troch soarchfâldich ûntworpen mjitkunde en de ynteraksje fan in protte fysike effekten lykas drukgradiënten, kapillêre aksje, elektrodynamika, magnetyske fjilden en akoestyske weagen [111].LOCC toant treflike foardielen yn hege-throughput screening en meardere opspoaren, mei flugge analyse snelheid, lytse stekproef grutte, lege enerzjyferbrûk, en hege behear en operaasje effisjinsje;lykwols, LOCC apparaten binne hiel delikaat, en manufacturing, packaging, en ynterfacing.Multiplexing en opnij brûke lykwols enoarme swierrichheden [96].Yn ferliking mei oare platfoarms, LOCC hat unike foardielen yn termen fan maksimale tapassing ferskaat en bêste technology komptabiliteit, mar syn neidielen binne ek dúdlik, nammentlik hege kompleksiteit en minne repeatability.Ofhinklikens fan eksterne pompen, dy't faaks bulk en djoer binne, beheint har gebrûk yn POCT fierder.
Tidens de COVID-19-epidemy krige LOCC in protte oandacht.Tagelyk binne d'r ferskate nije chips dy't ferskate technologyen kombinearje.Bygelyks, smartphones wurde no in protte brûkt as draachbere analytyske apparaten en hawwe in grut potensjeel foar LOCC-yntegraasje.Sun et al.[21] fabrisearre in mikrofluïdyske chip dy't it multiplexearjen fan spesifike nukleïnesûrsekwinsjes fan fiif patogenen mooglik makket, ynklusyf SARS-CoV-2, mei LAMP en analysearre se mei in smartphone binnen 1 oere nei it ein fan 'e reaksje.As in oar foarbyld, Sundah et al.[112] makke in molekulêre skeakel [katalytyske amplifikaasje troch molekulêre oergongsstatus-skeakel (CATCH)] foar direkte en gefoelige deteksje fan SARS-CoV-2 RNA-doelen mei smartphones. CATCH is kompatibel mei draachbere LOCC en berikt superieure prestaasjes (sawat 8 RNA-kopyen / μl; <1 h by keamertemperatuer) [112]. CATCH is kompatibel mei draachbere LOCC en berikt superieure prestaasjes (sawat 8 RNA-kopyen / μl; <1 h by keamertemperatuer) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC en обеспечивает превосходную производительность (foar 8 копий РННН/1мкон РНЕН/1примент; CATCH is kompatibel mei draachbere LOCC en leveret poerbêste trochfier (sawat 8 RNA-kopyen / µl; <1 h by keamertemperatuer) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH совместим с PORTATIвными LOCC en обладает превосходной производительностью (foar 8 копий РНак/1 превосходной производительностью; CATCH is kompatibel mei draachbere LOCC's en hat poerbêste prestaasjes (sawat 8 RNA-kopyen / µl; <1 oere by keamertemperatuer) [112].Derneist brûke LOCC-apparaten foar molekulêre diagnostyk ek guon driuwende krêften lykas fakuüm, stretch en elektryske fjilden.Kang et al.[113] demonstrearre in real-time, ultrasnelle nanoplasma-op-a-chip PCR foar rappe en kwantitative diagnoaze fan COVID-19 op it fjild mei in fakuüm plasmonyske floeibere PCR-chip.Li et al.[114] ûntwikkele dêrnei in stretch-oandreaune mikrofluïdyske chip dy't de diagnoaze fan COVID-19 ynskeakele.It platfoarm brûkt it RT-LAMP-amplifikaasjesysteem om te bepalen as in stekproef kwalitatyf posityf of negatyf is.Later, Ramachandran et al.[115] berikte passende elektryske fjildgradiënten mei isotachophoresis (ITP), in selektive ion-fokustechnyk ymplementearre yn mikrofluidika.Mei ITP kin doel-RNA fan rauwe nasopharyngeale swabmonsters automatysk wurde suvere.Dan Ramachandran et al.[115] Kombinearjen fan dizze ITP-suvering mei ITP-ferbettere LAMP- en CRISPR-assays ûntdutsen SARS-CoV-2 yn minsklike nasopharyngeale swab en klinyske eksimplaren yn sawat 35 minuten.Boppedat komme der hieltyd nije ideeën op.Jadhav et al.[116] foarstelde in diagnostysk skema basearre op oerflak-ferbettere Raman-spektroskopy yn kombinaasje mei in mikrofluïdysk apparaat dat fertikaal oriïntearre goud / sulver-coated koalstofnanotubes of disposable electrospun mikro / nanotubes befettet.Membraan-funksjonalisearre ynboude filtermikrokanalen binne wegwerp.It apparaat adsorbearret firussen fan ferskate lichemsfloeistoffen / eksudaasjes lykas speeksel, nasopharynx en triennen.Sa is de firustiter oerfloedich en kin it firus sekuer identifisearre wurde troch de Raman-hântekening.
LOAD is in sintrifugale mikrofluïdyske platfoarm wêryn alle prosessen wurde regele troch in frekwinsjeprotokol dat in mikrostrukturearre substraat draait [110].It LOAD-apparaat wurdt karakterisearre troch it brûken fan sintrifugale krêft as in wichtige driuwende krêft.Fluids binne ek ûnderwurpen oan capillary, Euler en Coriolis krêften.Mei help fan in sintrifuge-apparaat wurde analyzes útfierd yn trochgeande floeibere operaasje fan in radiale nei binnen nei bûten, wêrtroch de needsaak foar ekstra eksterne buizen, pompen, actuators en aktive kleppen elimineert.Koartsein, ien kontrôle metoade simplifies operaasje.De krêften dy't op 'e flüssigens yn itselde mikrofluïdyske kanaal op deselde ôfstân fan it loadsintrum wurkje, binne gelyk, wat it mooglik makket om de kanaalstruktuer te werheljen.Sa, LOAD apparatuer is ienfâldiger en mear ekonomysk in ûntwerp en fabryk as konvinsjonele LOCC apparatuer, wylst de reaksjes binne foar it grutste part ûnôfhinklik en parallelized;lykwols, troch de hege meganyske sterkte fan centrifugal apparatuer, beskikber chip materiaal is beheind en lytse folumes binne dreech.nei de auto.Tagelyk binne de measte LOAD-apparaten ûntworpen foar allinich gebrûk, wat djoer is foar grutskalige deteksje [96, 117, 118, 119].
Yn 'e ôfrûne desennia hat LOAD, beskôge as ien fan' e meast tasizzende mikrofluïdyske apparaten, in soad omtinken krigen fan ûndersikers en fabrikanten.Sa hat LOAD brede akseptaasje krigen en is brûkt foar molekulêre diagnoaze fan ynfekteare patogenen [120, 121, 122, 123, 124], fral tidens de COVID-19-epidemy.Bygelyks, oan 'e ein fan 2020, Ji et al.[60] demonstrearre in direkte RT-qPCR-assay foar rappe en automatisearre parallelle deteksje fan SARS-CoV-2 en gryp A- en B-ynfeksjes yn keel swab-eksimplaren.Dan Xiong et al.[74] presintearre in LAMP-yntegreare discoïde mikrofluïdysk platfoarm foar rappe, krekte en simultane deteksje fan sân minsklike respiratory coronaviruses, ynklusyf SARS-CoV-2, binnen 40 minuten.In early 2021, de Oliveira et al.[73] demonstrearre in polystyrene toner sintrifugale mikrofluïdyske chip, mei de hân betsjinne mei in fingertop rotator, foar RT-LAMP molekulêre diagnoaze fan COVID-19.Later, Dignan et al.[39] presintearre in automatisearre draachbere sintrifugemikroapparaat foar suvering fan SARS-CoV-2 RNA direkt út buccale swabseksjes.Medved et al.[53] foarstelde in ynline SARS-CoV-2 aerosol sampling systeem mei in lyts folume rotearjende mikrofluïdyske fluorescent chip mei in deteksje limyt fan 10 kopyen / μL en in minimum syklus drompel fan 15 minuten.Suarez et al.[75] koartlyn rapporteare de ûntwikkeling fan in yntegreare modulêr sintrifugale mikrofluïdyske platfoarm foar de direkte deteksje fan SARS-CoV-2 RNA yn waarmte-ynaktivearre nasopharyngeale swabmonsters mei LAMP.Dizze foarbylden demonstrearje de grutte foardielen en belofte fan LOAD yn 'e molekulêre diagnostyk fan COVID-19.
Yn 1945 presintearre Muller en Clegg [125] foar it earst mikrofluïdyske kanalen op papier mei filterpapier en paraffine.Yn 2007 makke de Whitesides-groep [126] it earste funksjonele papierplatfoarm foar proteïne- en glukose-testen.Papier is in ideaal substraat wurden foar mikrofluidika.It papier hat ynherinte eigenskippen lykas hydrofilisiteit en poreuze struktuer, poerbêste biokompatibiliteit, licht gewicht, fleksibiliteit, opklapberens, lege kosten, gemak fan gebrûk en gemak.Klassike µPAD's besteane út hydrofiele / hydrofobe struktueren boud op papiersubstraten.Ofhinklik fan 'e trijediminsjonale struktuer kinne μPAD's wurde ferdield yn twadimensjonale (2D) en trijediminsjonale (3D) μPAD's.2D µPAD's wurde produsearre troch hydrofobe grinzen te foarmjen om mikrofluïdyske kanalen te foarmjen, wylst 3D µPAD's normaal wurde makke fan stapels lagen fan 2D mikrofluidysk papier, soms troch papierfolding, sliptechniken, iepen kanalen, en 3D-printsjen [96].Waterige as biologyske floeistoffen op 'e μPAD wurde primêr regele troch kapillêre krêft sûnder in eksterne krêftboarne, it fasilitearjen fan pre-opslach fan reagentia, sample-ôfhanneling en multiplex-deteksje.Sekuere streamkontrôle en multipleksdeteksje wurde lykwols hindere troch ûnfoldwaande deteksjesnelheid, gefoelichheid en werbrûkberens [96, 127, 128, 129, 130].
As in ûngewoan mikrofluïdysk platfoarm is μPAD breed befoardere en ûntwikkele foar de molekulêre diagnoaze fan ynfeksjesykten lykas HCV, HIV, en SARS-CoV-2 [131, 132].Foar selektive en gefoelige deteksje fan HCV, Tengam et al.[133] ûntwikkele in nije biosensor basearre op fluorescent papier mei in heul spesifike nukleïnesûrprobe basearre op pyrrolidinylpeptide.Nucleic soeren wurde kovalent ymmobilisearre op foar in part oksidearre cellulose papier troch reduktive alkylation tusken amino groepen en aldehyde groepen, en deteksje is basearre op fluorescence.Dizze sinjalen kinne lêzen wurde troch in spesjaal makke gadget mei in draachbere fluorescent kamera yn kombinaasje mei in mobile telefoan kamera.Later, Lu et al.[134] ûntwurp in papierbasearre fleksibele elektrode basearre op nikkel / gouden nanopartikels / koalstofnanotubes / polyvinylalkohol organometallyske ramtkompositen foar HIV-doeldeteksje troch DNA-hybridisaasje mei methyleneblau as DNA-redox-yndikator.Mear resint, Chowdury et al.[135] presintearre in hypotetysk platfoarmûntwerp foar point-of-care µPAD-testen mei rau pasjintspeeksel yn kombinaasje mei LAMP en draachbere ôfbyldingstechnology foar detectie fan COVID-19 analyten.
Laterale streamtests liede floeistoffen troch kapillêre krêften en kontrolearje floeistofbeweging troch de wettabiliteit en skaaimerken fan poreuze as mikrostrukturearre substraten.De laterale streamapparaten besteane út monster, konjugaat, incubator en deteksje, en absorberende pads.De nukleïnesûrmolekulen yn 'e LFA werkenne spesifike binders dy't foarôf opslein binne op 'e binende side en bine as kompleksen.As de flüssigens troch de ynkubaasje- en deteksjeplaten giet, wurde de kompleksen fêstlein troch de fangenmolekulen dy't op 'e test- en kontrôlelinen lizze, en resultaten sjen litte dy't direkt mei it bleate each kinne wurde lêzen.Typysk kin LFA yn 2-15 minuten foltôge wurde, wat flugger is as tradisjonele ûntdekking.Troch it spesjale meganisme fereasket LFA in pear operaasjes en fereasket gjin ekstra apparatuer, wat it tige brûkerfreonlik makket.It is maklik te meitsjen en te miniaturisearjen, en de kosten fan papierbasearre substraten binne leger.It wurdt lykwols allinich brûkt foar kwalitative analyse, en kwantitative deteksje is heul lestich, en de multiplexingfeardigens en trochfier binne heul beheind, en mar ien genôch nukleinsäure kin tagelyk ûntdutsen wurde [96,110,127].
Hoewol de measte tapassingen fan LFA rjochte binne op immunoassays, is it gebrûk fan LFA foar molekulêre diagnostyk yn mikrofluidyske chips ek effektyf en populêr [136].Yn it gefal fan hepatitis B firus, HIV en SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] foarstelde in up-konverzje nanopartikel LFA-platfoarm en toande de veelzijdigheid fan dit miniaturisearre en draachbere platfoarm troch gefoelige en kwantitative deteksje fan meardere doelen lykas HBV-nukleinsûr.Derneist, Fu et al.[138] demonstrearre in roman LFA basearre op oerflak-ferbettere Raman-spektroskopy foar de kwantitative analyze fan HIV-1 DNA by lege konsintraasjes.Foar rappe en gefoelige deteksje fan SARS-CoV-2, Liu et al.[85] ûntwikkele in mikrofluïdysk-yntegreare RPA-laterale streamanalyse troch RT-RPA te kombinearjen en in universele laterale streamdeteksjesysteem yn ien mikrofluïdysk systeem.
De tapassing fan ferskate mikrofluïdyske platfoarms ferskilt ôfhinklik fan spesifike stúdzjes, en profitearret folslein fan 'e mooglikheden en foardielen fan' e platfoarms.Mei betelbere kleppen, pompen en kanalen, LOCC is it meast wiidweidige platfoarm foar tapassing ferskaat en ynteroperabiliteit mei de grutste romte foar ûntwikkeling.Dêrom hoopje en riede wy oan dat de nijste stúdzjes wurde útfierd by LOCC as in earste poging en dat de betingsten wurde optimalisearre.Derneist wurdt ferwachte dat effisjinter en krekter metoaden ûntdutsen en brûkt wurde yn it systeem.LOAD blinkt út yn sekuere kontrôle fan floeistoffen fan besteande LOCC-apparaten en toant unike foardielen yn inkele driuwfearren troch sintrifugale krêft sûnder de needsaak foar eksterne driuwfearren, wylst parallelle antwurden apart en syngronisearre wurde kinne.Sa sil LOAD yn 'e takomst it wichtichste mikrofluïdyske platfoarm wurde mei minder manuele operaasjes en mear folwoeksen en automatisearre technologyen.It µPAD-platfoarm kombineart de foardielen fan LOCC en papierbasearre materialen foar lege kosten, ienmalige diagnoaze.Dêrom moat takomstige ûntwikkeling rjochtsje op handige en goed fêstige technologyen.Derneist is de LFA goed geskikt foar deteksje mei bleate each, en belooft sampleferbrûk te ferminderjen en deteksje te fersnellen.In detaillearre platfoarmfergeliking wurdt werjûn yn Tabel 2.
Digitale analyzes ferdiele de stekproef yn in protte mikroreaktors, dy't elk in diskrete oantal doelmolekulen befetsje [139, 140].Digitale assays biede signifikante foardielen foar it útfieren fan absolute kwantifikaasje troch tûzenen parallelle biogemyske eksperiminten tagelyk en yndividueel út te fieren yn mikronskaal kompartiminten ynstee fan yn in trochgeande faze.Yn ferliking mei tradisjonele mikrofluidika kinne kompartementreaksjes samplevolumint ferminderje, reaksje-effisjinsje ferheegje en maklik yntegreare wurde mei oare analytyske metoaden sûnder de needsaak foar kanalen, pompen, kleppen en kompakte ûntwerpen [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].De folgjende twa metoaden wurde brûkt yn digitale assays om te kommen ta unifoarme en krekte skieding fan oplossings, ynklusyf reagents en samples lykas sellen, nucleic soeren, en oare dieltsjes of molekulen: (1) drop emulsions eksploitearje floeibere ynterface ynstabiliteit;(2) array divyzje wurdt útfierd troch de geometryske beheinings fan it apparaat.Yn 'e earste metoade kinne druppels dy't reagents en samples yn mikrokanalen befetsje kinne wurde makke troch passive metoaden lykas ko-stream, crossflow, streamfocusing, stage emulsification, microchannel emulsification, en membranen troch viskeuze skuorkrêften en emulsifikaasje mei kanaalferoaring.lokalisaasje [143, 145, 146, 148, 149] of mei help fan aktive metoaden [150, 151], dy't ekstra enerzjy ynfiere troch elektryske, magnetyske, thermyske en meganyske kontrôle.Yn 'e lêste oanpak wurdt de bêste floeistoffolumuniformiteit yn mikrofluïdyske keamers dield troch romtlike struktueren fan deselde grutte te hâlden, lykas mikropits en oerflakarrays [152,153,154].Opmerklik binne druppels grutte streamseksjes dy't ek kinne wurde generearre en manipulearre op elektrode-arrays basearre op digitale mikrofluidika (DMF).Electrowetting fan dielectrics is ien fan 'e bêst studearre DMF teoryen, sûnt electrowetting fan dielectrics jout sekuere manipulaasje fan yndividuele drippen, it kontrolearjen fan de foarm fan de floeistof en asymmetrysk elektryske sinjalen dy't passe troch ferskate kanten [141, 144].De wichtichste operaasjes mei druppels yn DMF omfetsje sortearjen, splitsen en gearfoegjen [151, 155, 156], dy't kinne wurde tapast yn ferskate fjilden fan analyse, benammen yn molekulêre deteksje [157, 158, 159].
Digitale nukleïnesûrdeteksje is in molekulêre diagnostyske technology fan 'e tredde generaasje nei konvinsjonele PCR en kwantitative real-time PCR (qPCR), parallel mei sequencing mei hege trochset en floeibere biopsie.Yn 'e lêste twa desennia binne digitale nukleïnesoeren rap ûntwikkele op it mêd fan molekulêre diagnoaze fan ynfekteare patogenen [160, 161, 162].Absolute kwantifikaasje fan digitale nukleïnesûrdeteksje begjint mei it ynpakken fan samples en reagenzjes yn yndividuele fakjes om te soargjen dat elke doelsekwinsje deselde kâns hat om elk yndividueel fak yn te gean.Teoretysk kin elke seksje meardere doelsekwinsjes wurde tawiisd, of d'r kin gjin unôfhinklik mikroreaksjesysteem wêze.Troch de ferskate sensingmeganismen dy't hjirboppe beskreaun binne, kinne kompartiminten mei mikrobiele doelsekwinsjes dy't sinjalen generearje boppe in bepaalde drompel mei it bleate each of troch in masine sichtber wurde en wurde as posityf bestimpele, wylst oare kompartiminten dy't sinjalen generearje ûnder de drompel wurde markearre as posityf .negative, dy't it sinjaal foar elke seksje in boolean meitsje.Sa kinne, troch it berekkenjen fan it oantal oanmakke fakken en it taryf fan positive resultaten nei de reaksje, de orizjinele kopyen fan 'e testmonsters oerienkomme mei de Poisson-distribúsjeformule sûnder de needsaak foar in standertkromme, dy't nedich is foar routine kwantitative analyzes lykas as qPCR.[163] Yn ferliking mei tradisjonele molekulêre diagnostyske metoaden hat digitale nukleïnesûrdeteksje in hegere graad fan automatisearring, hegere analysesnelheid en gefoelichheid, minder reagenzjes, minder fersmoarging, en ienfâldiger ûntwerp en fabrikaazje.Om dizze redenen is it gebrûk fan digitale assays, foaral drop-basearre metoaden, foar molekulêre diagnostyk, kombinearjen fan amplifikaasje en sinjaallêstechniken, goed ûndersocht tidens de krityske útbraak fan SARS-CoV-2.Bygelyks, Yin et al.[164] kombinearre droplet digitale en rappe PCR-metoaden om de ORF1ab-, N- en RNase P-genen yn SARS-CoV-2 te detektearjen yn in mikrofluïdyske chip.Opmerklik koe it systeem in posityf sinjaal binnen 115 sekonden identifisearje, wat rapper is dan konvinsjonele PCR, wat de effektiviteit oanjout yn deteksje fan soarchpunt (figuer 7a).Dong et al.[165], Sjoerd et al.[157], Chen et al.[166], Alteri et al.[167] tapast ek droplet digitale PCR (ddPCR) om SARS-CoV-2 te detektearjen yn in mikrofluïdysk systeem mei yndrukwekkende resultaten.Om de deteksjerate fierder te ferbetterjen, Shen et al.[168] berikte ddPCR-basearre chipôfbylding yn sa min as 15 s sûnder it brûken fan techniken foar ôfbyldingsstiksels, wêrtroch it proses fan ddPCR-technology fan laboratoarium nei tapassing fersnelt.Net allinich termyske amplifikaasjemetoaden lykas PCR wurde tapast, mar ek isothermyske amplifikaasjemetoaden wurde brûkt om reaksjebetingsten en rappe reaksje te ferienfâldigjen.Lu et al.[71] ûntwikkele SlipChip foar druppelanalyse, yn steat om druppels fan ferskate grutte by hege tichtheden yn ien stap te generearjen en SARS-CoV-2-nukleïnesoeren te kwantifisearjen mei digitale LAMP (figuer 7b).As in rap evoluearjende technology kin CRISPR ek in wichtige rol spylje yn digitale deteksje fan nukleïnesûr troch handige kolorimetryske ôfbylding sûnder de needsaak foar ekstra nukleïnesûrflekken.Akkerman et al.ûntwikkele in kombinatoryske matrixreaksje foar multiplex evaluaasje fan nukleïnesoeren.[158] ûntdutsen 169 minsklike assosjearre firussen, ynklusyf SARS-CoV-2, yn druppels dy't CRISPR-Cas13-basearre nukleïnsûre-deteksjereagenzjes befetsje yn in mikrowell-assay (figuer 7c).Derneist kinne isothermyske amplifikaasje en CRISPR-technology yn itselde systeem brûkt wurde om de foardielen fan beide te kombinearjen.Park et al.[169] In CRISPR/Cas12a digitale assay waard ûntwikkele yn in kommersjele mikrofluïdyske chip foar de deteksje fan ekstrahearre en troch waarmte fermoarde SARS-CoV-2 basearre op in ienstaps RT-RPA mei in koartere en hegere sinjaal-nei-eftergrûndeteksje tiid ferhâlding., breder dynamysk berik en bettere gefoelichheid (figuer 7d).Guon beskriuwingen fan dizze foarbylden wurde jûn yn Tabel 3.
Typysk digitaal platfoarm foar deteksje fan nukleïnesoeren.a De rappe digitale PCR-workflow bestiet út fjouwer wichtige stappen: sample tarieding, distribúsje fan it reaksje mingsel, amplification proses, en doel kwantifikaasje (oanpast fan [164]).b Skematyske showing analyze fan SlipChip druppels foar droplet formaasje by hege tichtheid (oanpast fan [71]).c CARMEN-Cas workflow diagram13 (oanpast fan [158]).d Oersjoch fan avansearre digitale firusdeteksje mei CRISPR / Cas yn ien pot (oanpast fan [169]).W/O wetter-yn-oalje, polydimethylsiloxane PDMS, PCR-polymerase-kettingreaksje, DAQ-gegevenssammeling, PID-proporsjonele yntegraal derivative, CARMEN-kombinatoriale matrixreaksje foar multiplex nukleïnesûr-evaluaasje, SARS-CoV-2, swier akute respiratory syndrome, coronavirus 2, RT Amplification fan reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, S / B sinjaal op 'e eftergrûn